[發明專利]一種重組大腸桿菌高密度培養生產四氫嘧啶的方法

有效

• 申請號: 201310534045.2
• 申請日: 2013-11-01
• 公開（公告）號: CN104593442B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 董志揚;何永志;張山;畢建成
• 申請（專利權）人: 南京眾惠生物材料科技有限公司
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

1.一種制備四氫嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸鈉的溶液中加入重組大腸桿菌，經生物轉化反應后即得；其中，所述重組大腸桿菌能夠表達SEQ ID No：2所示蛋白、SEQ ID No：3所示蛋白和SEQ ID No：4所示蛋白；

所述重組大腸桿菌為含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重組大腸桿菌：

1)序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

2)編碼序列表中SEQ ID No：2、SEQ ID No：3和/或SEQ ID No：4所示蛋白質序列的多核苷酸序列；

所述重組大腸桿菌為將重組載體導入出發大腸桿菌后得到的；所述出發大腸桿菌為帶有ΔaraBAD阿拉伯糖代謝缺陷性狀的大腸桿菌；

所述重組載體為在出發載體pBAD/HisA的多克隆位點插入SEQ ID No.1所示核酸序列的DNA片段所得的質粒；

所述重組大腸桿菌為大腸埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC，其保藏編號為CGMCC NO.8334；

所述生物轉化反應的過程包括：將所述重組大腸桿菌進行誘導培養，得到含有表達了SEQ ID No：2所示蛋白、SEQ ID No：3所示蛋白和SEQ ID No：4所示蛋白的重組大腸桿菌的誘導培養液；向所述誘導培養液中加入所述含L-天冬氨酸鈉的溶液至L-天冬氨酸鈉終濃度為200mM；轉化培養至葡萄糖被消耗完，開始補加所述含L-天冬氨酸鈉的溶液，所述含L-天冬氨酸鈉的溶液的流加速度為40mL/h，繼續進行轉化培養，繼續轉化培養過程中一直補加所述含L-天冬氨酸鈉的溶液；轉化培養結束即得四氫嘧啶轉化液。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述含L-天冬氨酸鈉的溶液由溶質和溶劑組成，溶質及其在所述含L-天冬氨酸鈉的溶液中的濃度如下：

溶劑為水。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生物轉化反應的條件包括：轉化溫度為30℃，控制生物轉化反應體系的溶氧在20％以上，和維持pH至7.0。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“將所述重組大腸桿菌進行誘導培養，得到含有表達了SEQ ID No：2所示蛋白、SEQ ID No：3所示蛋白和SEQ ID No：4所示蛋白的重組大腸桿菌的誘導培養液”的方法包括下述1)和2)：

1)菌體培養過程：將300mL所述重組大腸桿菌的種子液接種于2.7L含100μg/ml氨芐青霉素的發酵培養基中，攪拌培養至葡萄糖消耗完時流加補料培養基，補料培養基的流加速度為50mL/h，流加至菌體密度OD600達到50，菌體培養過程結束，進入誘導培養階段；

2)誘導培養過程：將上述菌體培養后的發酵液的溫度降至30℃，加入L-阿拉伯糖，使得L-阿拉伯糖終濃度為1g/L，進行誘導培養；誘導培養過程中要一直流加補料培養基，補料培養基的流加速度調至20mL/h；當重組蛋白EctABC的表達量不再增加時，誘導培養過程結束；

所述菌體培養的條件為：培養溫度為37℃，控制菌體培養體系的溶氧在20％以上，和維持pH至7.0；

所述誘導培養的條件為：培養溫度為30℃，控制誘導培養體系的溶氧在20％以上，和維持pH至7.0；

每1L發酵培養基的配制：葡萄糖10g,(NH₄)₂HPO₄ 8g,KH₂PO₄ 13.3g,MgSO₄·7H₂O 1.2g,檸檬酸1.7g,微量鹽溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH調至pH7.0；

每1L補料培養基的配制：葡萄糖400g,MgSO₄·7H₂O 10g,微量鹽溶液20mL,用水定容至1L；

每1L微量鹽溶液的配制：FeSO₄·7H₂O 10g,ZnSO₄·7H₂O 2.25g,CuSO₄·5H₂O 1g,MnSO₄·5H₂O 0.5g,Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23g,CaCl₂·2H₂O 2g,(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g，用5M鹽酸水溶液定容，定容至1L。