[發(fā)明專利]郁金香類黃酮-3’-羥化酶TfF3’H蛋白及其編碼基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310533249.4
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103589694A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 袁媛;史益敏;唐東芹;馬曉紅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中;牛山

技術領域

本發(fā)明涉及郁金香花色苷合成途徑中的關健酶及其編碼基因，具體涉及一種郁金香類黃酮-3’-羥化酶TfF3’H蛋白及其編碼基因，屬于分子技術領域。

背景技術

花的顏色是影響植物傳粉的重要因素，同時也決定一種花卉的商品價值和觀賞價值。改變花色，創(chuàng)造新花色，可以增加花卉的商品價值和觀賞價值。花朵的顏色是花瓣細胞中積累花色素的結果，花色素主要包括類黃酮、類胡蘿卜素以及甜菜堿類。類黃酮是花色素的一大類，它使花朵產生從黃到紫的全部顏色。

類黃酮-3’-羥化酶（flavonoid3’-hydroxylase,F3’H，以前文獻中曾稱為二氫黃酮醇-3’-羥化酶，現(xiàn)多稱為類黃酮-3’-羥化酶）屬于細胞色素P450單加氧酶，它具有催化多種依賴NADPH或NADH的底物氧化反應的功能，在植物類黃酮的合成以及次生代謝中起重要作用。它能在輔因子NADPH和O₂的作用下，催化單加氧反應，分別將柚皮素（naringenin）和二氫山奈酚（dihydrokaempferol）B-環(huán)的3’位置羥基化，催化形成圣草酚和二氫槲皮素。而圣草酚和二氫槲皮素是合成花色素的重要前體物質，是花的重要成色物質，對于花青素的生物合成起重要作用，從而形成不同的花色素苷，使植物表現(xiàn)不同的花色。F3’H基因的表達活性會直接影響花朵的最終顏色，例如在矮牽牛中表達其自身得到的F3’H基因使得缺失F3’H基因和F3’5’H基因的淡粉色矮牽牛變?yōu)樯罘凵粚埬慒3’H基因轉化入煙草中，發(fā)現(xiàn)在轉基因煙草體內出現(xiàn)花青素和槲皮素含量的增加，從而影響了煙草的花色；F3’H基因的缺失時，裂葉牽牛（Ipomoea?nil）、三色牽牛（Ipomoea?tricolor）和圓葉牽牛（Ipomoea?purpurea）會產生含有天竺葵色素衍生物的淺紅色的花。因此，對F3’H基因表達進行調控是改變花色的途徑之一。

F3’H基因已在多種植物中得到克隆，但在郁金香（Tulipa?fosteriana）中，F(xiàn)3’H基因的克隆、表達模式及F3’H蛋白編碼序列目前尚不清楚。目前，未有任何與郁金香F3’H蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明填補郁金香F3’H基因家族成員的克隆、表達模式分析以及郁金香F3’H蛋白及其編碼基因的空白，提供了一種郁金香TfF3’H蛋白序列，本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。本發(fā)明公開了郁金香TfF3’H蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同發(fā)育階段的表達模式；構建了TfF3’H基因過表達載體并轉化煙草，分析了TfF3’H基因對轉基因煙草花色苷合成及花色的影響。利用本發(fā)明提供的郁金香類黃酮3’-羥化酶TfF3’H，能為基因工程改變花色，獲得創(chuàng)新花色提供一種有效的技術手段。此外，此外，利用本發(fā)明的郁金香TfF3’H基因，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與F3’H發(fā)生相互用的物質、受體、抑制劑或拮抗劑等。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，

本發(fā)明目的在于提供一種具有郁金香類黃酮-3’-羥化酶活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香類黃酮-3’-羥化酶活性的由（a）衍生的蛋白質。該蛋白質在花朵花瓣的不同著色階段、不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。

優(yōu)選的，所述蛋白質為SEQ?ID?NO.4所示氨基酸序列經過1～50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20個以內氨基酸而得到的序列。

進一步優(yōu)選的，所述蛋白質為SEQ?ID?NO.4所示氨基酸序列中1～10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。

另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。

優(yōu)選的，所述核酸序列具體為：

（a）堿基序列如SEQ?ID?NO.3第1～1533位所示；

或（b）與SEQ?ID?NO.3第1～1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；

或（c）能與SEQ?ID?NO.3第1～1533位所示的核酸進行雜交的序列。

優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ?ID?NO.3第1～1533位所示的核酸序列中1～90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60個以內核苷酸形成的序列。