[發(fā)明專(zhuān)利]陽(yáng)性菌落中重組蛋白表達(dá)載體的鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310531364.8
• 申請(qǐng)日: 2013-11-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103614462A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 劉軍
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生化實(shí)驗(yàn)方法，具體來(lái)說(shuō)，是指陽(yáng)性菌落中重組蛋白表達(dá)載體的鑒定方法。

背景技術(shù)

菌落PCR（Colony?PCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省時(shí)少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進(jìn)行重組體的篩選或者DNA測(cè)序分析。最后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。菌落PCR與我們通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以單個(gè)菌作為模板。是一種可以快速鑒定菌落是否為含目的質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落。操作簡(jiǎn)單，快捷，陽(yáng)性率較高，在轉(zhuǎn)化鑒定中較常見(jiàn)。設(shè)計(jì)引物很關(guān)鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯(cuò)誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時(shí)挑取的菌體不宜太多，否則會(huì)有非特異性擴(kuò)增。使用的引物濃度不能太高，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)的循環(huán)數(shù)也不能太多，一般不超過(guò)25個(gè)。同時(shí)因?yàn)閿U(kuò)增的片段的GC含量問(wèn)題，有的GC含量很低，有的又很高，導(dǎo)致菌落PCR不容易擴(kuò)增出目的條帶，在此建議在設(shè)置PCR程序時(shí)以高GC的溫度為上限，每一循環(huán)降0.2度左右。

發(fā)明內(nèi)容

為克服上述技術(shù)問(wèn)題，我們提出了以下技術(shù)方案：

陽(yáng)性菌落中重組蛋白表達(dá)載體的鑒定方法，步驟如下：首先在LB平板上植入目的菌落；24小時(shí)后從LB平板上挑取適當(dāng)?shù)膯尉渥鳛槟０妫怀醪胶Y選到具有插入片段的克隆；根據(jù)載體信息，重組蛋白檢測(cè)；將穩(wěn)定表達(dá)PERV的進(jìn)行模型建立；對(duì)比陽(yáng)性擴(kuò)增片段，證實(shí)已感染PERV的菌落；連續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月后對(duì)照，依然穩(wěn)定表達(dá)的菌落即為所需目的菌落。

本發(fā)明中，一個(gè)月的培養(yǎng)期中應(yīng)該使其在35攝氏度的環(huán)境下保存。

本發(fā)明中，重組蛋白的時(shí)候，滴入含有安卡青霉素的溶液，濃度百分比至少為15%。

本發(fā)明的有益效果是，可以有效鑒定PCR，同時(shí)效果明顯，表達(dá)清楚、穩(wěn)定，為下一步能夠成功建立模型奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

陽(yáng)性菌落中重組蛋白表達(dá)載體的鑒定方法，步驟如下：首先在LB平板上植入目的菌落；24小時(shí)后從LB平板上挑取適當(dāng)?shù)膯尉渥鳛槟０妫怀醪胶Y選到具有插入片段的克隆；根據(jù)載體信息，重組蛋白檢測(cè)；將穩(wěn)定表達(dá)PERV的進(jìn)行模型建立；對(duì)比陽(yáng)性擴(kuò)增片段，證實(shí)已感染PERV的菌落；連續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月后對(duì)照，依然穩(wěn)定表達(dá)的菌落即為所需目的菌落；一個(gè)月的培養(yǎng)期中應(yīng)該使其在35攝氏度的環(huán)境下保存；滴入含有安卡青霉素的溶液，濃度百分比為15%。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。