[發(fā)明專利]一種能夠有效篩選shRNA片段的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310531291.2
• 申請日: 2013-11-01
• 公開（公告）號: CN103614461A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉軍
• 申請（專利權(quán)）人: 劉軍
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生化實驗方法，具體來說，是指一種能夠有效篩選shRNA片段的方法。?

背景技術(shù)

菌落PCR（Colony?PCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省時少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進(jìn)行重組體的篩選或者DNA測序分析。最后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。菌落PCR與我們通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以單個菌作為模板。是一種可以快速鑒定菌落是否為含目的質(zhì)粒的陽性菌落。操作簡單，快捷，陽性率較高，在轉(zhuǎn)化鑒定中較常見。設(shè)計引物很關(guān)鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴(kuò)增。使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)的循環(huán)數(shù)也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴(kuò)增的片段的GC含量問題，有的GC含量很低，有的又很高，導(dǎo)致菌落PCR不容易擴(kuò)增出目的條帶，在此建議在設(shè)置PCR程序時以高GC的溫度為上限，每一循環(huán)降0.2度左右。?

發(fā)明內(nèi)容

為克服上述技術(shù)問題，我們提出了以下技術(shù)方案：?

一種能夠有效篩選shRNA片段的方法，步驟如下：首先選擇事情設(shè)計好的目標(biāo)shＲＮＡ，將其連接與目標(biāo)載體中；將需要重組的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至sh?RNA中；組件中采用多重比較法進(jìn)行比較，當(dāng)其轉(zhuǎn)染上細(xì)菌后，選擇最有效的基因沉默；再與其他實驗組進(jìn)行比對，對于最有效的干擾質(zhì)粒，即為需要選擇的sh?RNA片段。

本發(fā)明中，重組蛋白的時候，滴入含有安卡青霉素的溶液，濃度百分比至少為15%。?

本發(fā)明中，表達(dá)綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒24小時內(nèi)可以在熒光顯微鏡下進(jìn)行篩選。?

本發(fā)明的有益效果是，可以有效鑒定PCR，同時效果明顯，表達(dá)清楚、穩(wěn)定，為下一步能夠成功建立模型奠定堅實基礎(chǔ)。?

具體實施方式

一種能夠有效篩選shRNA片段的方法，步驟如下：首先選擇事情設(shè)計好的目標(biāo)shＲＮＡ，將其連接與目標(biāo)載體中；將需要重組的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至sh?RNA中；組件中采用多重比較法進(jìn)行比較，當(dāng)其轉(zhuǎn)染上細(xì)菌后，選擇最有效的基因沉默；再與其他實驗組進(jìn)行比對，對于最有效的干擾質(zhì)粒，即為需要選擇的sh?RNA片段。本發(fā)明中，重組蛋白的時候，滴入含有安卡青霉素的溶液，濃度百分比為15%；表達(dá)綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒24小時內(nèi)可以在熒光顯微鏡下進(jìn)行篩選。?

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。?