[發(fā)明專利]一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310529396.4
• 申請日: 2013-10-31
• 公開（公告）號: CN103548683A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王躍華;張玨;王金鵬;陳燕;劉銀花;宋超;段茂華;任鵬飛;楊霞
• 申請（專利權(quán)）人: 成都大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 成都科奧專利事務(wù)所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重樓植物的組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法。

背景技術(shù)

中國藥典規(guī)定的中藥重樓為滇重樓(Paris?polyphylla?var.yunnanensis)和華重樓(Paris?polyphylla?var.chinensis)的地下莖，前者主產(chǎn)于云南，后者主產(chǎn)于四川。《神農(nóng)本草經(jīng)》最早記載的蚤休即華重樓。重樓具有清熱解毒、消炎止痛、活血化淤、涼肝定驚的功效。

近年來因發(fā)現(xiàn)重樓具有抗病毒、抗腫瘤作用而需求量大增。重樓中藥材歷來以野生資源提供藥用，近年來由于對野生資源的過度采挖，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，現(xiàn)己瀕臨滅絕，因而大力開發(fā)重樓植物資源具有十分重要的意義。

目前制約重樓植物規(guī)模化栽種的主要問題是重樓種苗的短缺。重樓種子由于存在種胚發(fā)育不完全，胚乳堅(jiān)硬，胚軸后熟等明顯“雙重休眠”特性，因此播種后通常需要經(jīng)歷兩冬一夏才能萌發(fā)成苗，是典型的“二年生種子”，而且在自然狀態(tài)下，即使經(jīng)過了長時(shí)間休眠，重樓種子的出苗率也不高，因此目前僅靠重樓種子進(jìn)行有性繁殖已無法滿足重樓植物大面積栽種的需要。

植株胚狀體是由構(gòu)成植物體的細(xì)胞在組織培養(yǎng)條件下，通過類似于受精卵形成的合子發(fā)育成胚的過程而形成的體細(xì)胞胚體。胚狀體具有植物胚的特性，在條件允許的情況下可快速生長為再生植株，可有效解決重樓種苗短缺的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法，該方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚狀體，在適當(dāng)?shù)臈l件下可快速生長為再生植株，從而可實(shí)現(xiàn)重樓再生植株的快速繁殖。

本發(fā)明提供的以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法包括下列步驟：

（1）取重樓根莖上生長健壯、且未萌發(fā)的芽體，先用自來水沖洗干凈后陰干，然后進(jìn)行消毒處理，接著用無菌水震蕩洗滌后，用已滅菌的濾紙反復(fù)吸干芽體表面的水分，然后接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5～3.0mg·L^-1+水楊酸20～80mg·L^-1中，在培養(yǎng)溫度為16～22℃、每天光照6～14小時(shí)、光照強(qiáng)度為1000～2000lx的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；

（2）選取預(yù)培養(yǎng)后體積明顯膨大的芽體，在超凈工作臺上先將芽鞘切去，然后將芽軸進(jìn)行縱切，將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5～2.0mg·L^-1+NAA0.5～2.0mg·L^-1+2，4-D1.0～4.0mg·L^-1中，在培養(yǎng)溫度為12～26℃、每天光照4～16小時(shí)、光照強(qiáng)度為1000～2000lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

（3）將由芽軸產(chǎn)生的已愈傷化的組織切成1～3cm³的大小接入LS+6-BA0.5～2.0mg·L^-1+NAA0.5～4.0mg·L^-1培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為16～28℃、每天光照8～12小時(shí)、光照強(qiáng)度為1200～2500lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)25～45天繼代一次，連續(xù)進(jìn)行2～4次繼代培養(yǎng)，獲得重樓胚性組織；

（4）將重樓胚性組織切成0.5～2.5cm³的大小接入LS+6-BA2.0～4.0mg·+IAA0.5～2.0mg·L^-1+頭孢噻肟鈉100～400mg·L^-1培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為5～10℃、每天光照2～6小時(shí)、光照強(qiáng)度為400～1000lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)50～70天后，在胚性組織表面產(chǎn)生白色圓球形的胚狀體。

上述所有培養(yǎng)基還包括瓊脂5.0～7.0g·L^-1和蔗糖20～60g·L^-1，培養(yǎng)基的pH值為5.6～6.5、

上述步驟（1）中所述消毒處理是指在超凈臺上先用濃度為70%～75%的酒精消毒10～60s，再用濃度為0.1%～0.15%的升汞消毒4～10min。

本發(fā)明首次提出了以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法,該方法在一定程度上解決了重樓植物大規(guī)模栽種時(shí)對種源需求的問題，為重樓優(yōu)良品種的培育和組培苗的大量快速繁殖提供了一條新途徑，可實(shí)現(xiàn)重樓短時(shí)間、低成本、大批量生產(chǎn)。

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1