[發明專利]豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法

有效

• 申請號: 201310529342.8
• 申請日: 2013-10-31
• 公開（公告）號: CN103550771A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 徐宏軍;胡來根;楊鵬程;任麗;王家福
• 申請（專利權）人: 成都天邦生物制品有限公司
• 主分類號: A61K39/225
• 分類號: A61K39/225;A61P31/14;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 劉興亮

1.一種豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟一：生產用細胞的傳代與培養：取生長良好的PK15或ST細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，培養溫度為37℃，形成良好單層PK15或ST細胞；

步驟二：生產用種毒的繁殖：在PK15細胞或ST細胞形成單層后，倒掉細胞生長液，將豬傳染性胃腸炎病毒接種到步驟一的單層細胞上，豬傳染性胃腸炎病毒的接種量與步驟一中細胞生長液的體積比為1:10，將細胞瓶迅速翻轉使傳染性胃腸炎病毒充分浸沒單層細胞，置于37℃、體積百分含量為5%的二氧化碳培養箱中吸附1h，然后加入細胞維持液，置于37℃、體積百分含量為5%的二氧化碳培養箱培養，逐日觀察，當75%～80%細胞出現病變時，收獲病毒置于-15℃冰箱中，反復凍融細胞三次，此病毒液作為生產用種毒；

步驟三：PK15或ST細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養：向無菌檢驗合格的、含有微載體的生物反應器中加入總培養體積的2/3體積的細胞生長液，取步驟一中已形成良好單層PK15或ST細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按5×10⁵個細胞/ml～5×10⁶個細胞/ml的密度接種于生物反應器中進行培養；

步驟四：制苗毒液的繁殖：觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數結果達到5×10⁶個細胞/ml～5×10⁷個細胞/ml后進行接毒操作，所接入種毒為步驟二中的生產用種毒，接毒前用含有10μg/ml胰酶的病毒培養液洗滌生產用種毒2-4次；

步驟五：病毒液的收獲：待微載體上細胞全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，將反應器內液體連同微載體一起收獲，置于-20℃反復凍融兩次，然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片，即制得病毒液。

2.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數，適用于微載體懸浮培養的生物反應器，容積為3L-3000L。

3.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述微載體為Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3中的一種。

4.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述微載體在使用前需清洗、滅菌，步驟如下：A、用PBS浸泡微載體過夜；B、用PBS清洗微載體3遍；C、用PBS浸泡微載體，121℃蒸汽滅菌三十分鐘，微載體經PBS清洗、高壓滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反應器中，在反應器中用DMEM清洗微載體。

5.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述EDTA-胰酶細胞分散液為含有質量體積分數為0.25%的規格1：250的胰酶和0.02%的EDTA的Hank's液，所述的規格1：250的胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶。

6.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述細胞生長液的配方為：重量分數為90%-98%DMEM液、2%-10%牛血清，終濃度為200-1000單位/ml的抗菌素，pH為6.8-7.6。

7.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述步驟四中的病毒培養液的配方為：重量分數分別是90%-95%DMEM液，5%-10%牛血清，終濃度為200-1000單位/ml的抗菌素，pH為6.8-7.6。

8.根據權利要求6或7所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述抗菌素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。

9.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述步驟四中的生產用種毒接種量為0.01-0.5MOI。

10.根據權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產方法，其特征在于所述的生物反應器設定的參數為培養溫度37℃、pH6.8-7.6、溶氧30%-60%、攪拌速度30-60rpm。