[發明專利]偽狂犬病毒疫苗的生產方法

有效

• 申請號: 201310529245.9
• 申請日: 2013-10-31
• 公開（公告）號: CN103550772A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 徐宏軍;胡來根;任麗;張奕強;岳豐雄
• 申請（專利權）人: 成都天邦生物制品有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61P31/22;C12N7/04;C12R1/93
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 劉興亮

技術領域

本發明實施例涉及一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法，具體涉及一種利用生物反應器微載體細胞懸浮培養生產偽狂犬病毒疫苗的方法。

背景技術

目前，國內偽狂犬病毒的疫苗生產唯一依靠轉瓶培養法實現。該傳統工藝勞動強度大，耗時長、效率低，生產成本高；容易被環境污染；轉瓶培養不同批次間的差異大；所需空間多；轉瓶培養操作時被細菌或其它病毒污染可能性增大，因而致生產的疫苗或有質量隱患；轉瓶培養時一旦發生污染，由于轉瓶數量多，因而無害化處理難度大，涉及生物安全和公共衛生問題。另外，目前已經有利用生物反應器微載體培養狂犬病疫苗的報道，但尚沒有利用生物反應器微載體生產偽狂犬病毒的報道。

發明內容

本發明的目的在于解決上述現有技術的缺陷，提供一種生產成本低、生產周期短的應用生物反應器微載體細胞培養生產偽狂犬病毒疫苗的方法。

為解決上述的技術問題，本發明采用以下技術方案：一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法，包括以下步驟：

（1）制苗用細胞的傳代與培養：取細胞培養瓶中生長良好的傳代細胞系細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養，培養溫度為37℃，形成致密細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養；

（2）制苗用毒種的繁殖：將毒種用DMEM細胞培養基配制的細胞維持液稀釋10倍，接種細胞單層，培養48～72小時，當細胞病變達75%以上時，收獲感染細胞毒液，即為生產用毒種；

（3）傳代細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養：取步驟（1）中已形成的細胞單層，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，按5×10⁵/mL～5×10⁶/mL的細胞密度接種于生物反應器中，在生物反應器中加入微載體，設定培養條件為：溫度37℃、pH6.8～7.6、溶氧30%～60%和攪拌速度30～60轉/分鐘；

（4）制苗毒液的繁殖：當細胞達到5×10⁶/mL～5×10⁷/mL后進行接毒操作，所接入毒種為步驟（2）中生產的毒種，接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培養液將長滿細胞的微載體洗滌2～4次，設定培養條件為：溫度37℃、pH6.8～7.6、溶氧30%～60%和攪拌速度30～60轉/分鐘；

（5）偽狂犬病毒疫苗的收獲：待微載體上細胞全部脫落，且溶解氧值呈明顯上升趨勢，將反應器內液體連同微載體一起收獲，置與-20℃條件下反復凍融2次，然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片，即制得偽狂犬病毒疫苗。

在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中，優選的是，步驟（1）中所述的傳代細胞系為BHK-21細胞系、PK-15細胞系、IBRS-2細胞系、Marc-145細胞系、Vero細胞系或ST細胞系。

在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中，優選的是，所述生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度參數的生物反應器，所述生物反應器的容積為3L～3000L。

在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中，優選的是，所述微載體為以交聯葡聚糖為基質，用帶有正電荷的N,N-二乙氨乙基基團進行一定程度取代的Cytodex系列微載體。

在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中，優選的是，所述微載體在使用前需清洗、滅菌，具體方法為：用PBS浸泡微載體過夜，然后用PBS清洗微載體3遍，再用PBS浸泡微載體，121℃蒸汽滅菌30分鐘，微載體經清洗、滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反應器中，用高糖型DMEM清洗，PBS為磷酸鹽緩沖液，pH=7.4，與人體血液等滲，主要成分為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉以及氯化鉀；DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養基，分為高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。

在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中，優選的是，所述EDTA-胰酶細胞分散液是由質量體積分數為0.25%的規格為1：250的胰酶、質量體積分數為0.02%的EDTA的Hank's液組成，所述規格1：250胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶，Hank's液是一種平衡鹽溶液。

在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中，優選的是，所述細胞生長液由重量分數90%～98%的DMEM液、重量分數2%～10%的牛血清及100～500單位/ml的抗菌素組成，所述細胞生長液pH為6.8～7.6。