[發明專利]一種豬圓環病毒2型的生產方法

無效

• 申請號: 201310529147.5
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103550769A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 徐宏軍;丁光星;任麗;趙英杰;胡來根;劉玉才
• 申請（專利權）人: 成都天邦生物制品有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;C12N7/04;C12R1/93
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 劉興亮

1.一種豬圓環病毒2型的生產方法，其特征在于：

選擇生物反應器作為培養工具；選擇微載體作為細胞貼附的生長載體；選擇pK-15A1#細胞作為制苗用細胞；

(1)、制苗用細胞的傳代與接種

將致密單層的pK-15A1#細胞經消化液消化分散后取樣計數，用含10%NBCS的MEM生長液將pK-15A1#細胞調整為2-3×10⁵個/ml，再接種到生物反應器上進行培養；所述培養條件為：溫度為37.0℃±0.2℃，pH值為7.40，DO為40%-80%，轉速為40rpm-80rpm；

(2)、制苗用細胞的接毒

將在生物反應器中培養的pK-15A1#細胞按照體積比1%-5%接種PCV2病毒，接毒后按照所述培養條件繼續培養；

(3)、接毒后的培養

接毒后在細胞培養12h時補加200μmol/L的必需氨基酸；在細胞培養約24h時更換含10%NBCS的MEM生長液一次；在細胞培養48h時，細胞長滿微載體50%-60%，吸出MEM生長液后，用預熱的無菌PBS洗滌兩次，再加入含2%NBCS和1%D-氨基葡萄糖的MEM維持液繼續培養；

（4）、病毒的收獲與效價檢測

維持液培養后約54h后停止攪拌，靜置5min后吸出上清作為一收，此后加入MEM維持液繼續培養48h，靜置后吸出上清，收獲為二收，此后加入MEM維持液繼續培養48h，此時將微載體和培養液一起全部收獲，凍融三次后作為抗原保存。

2.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型的生產方法，其特征在于：所述的生物反應器容積為3L-3000L，所采用的微載體為Cytodex系列，微載體的使用濃度為3-5g/L，生物反應器在使用前需要進行電極校正，滅菌，平衡，方法如下；

（1）生物反應器的準備：

根據培養的體積選擇合適的生物反應器，連接好各種管道和補料，換液的接口，接上T，pH，DO電極，參照使用說明書上的方法進行電極的校正；

（2）微載體的準備：

根據培養的體積和選定的微載體濃度稱取適量的Cytodex-1微載體于已硅化處理的玻璃瓶中或不銹鋼容器中，加入約50倍微載體質量的PBS緩沖液浸泡（如10g微載體加入500ml的PBS）30min，此后更換新鮮的PBS繼續浸泡2h；更換10倍體積的PBS于待滅菌的生物反應器中準備滅菌；

（3）滅菌：

滅菌前認真檢查各管道和接頭確保連接完好后進行氣密性測試，測試合格后方可準備進行滅菌；根據生物反應器的規模，5L及5L以下一般采用離線滅菌，在高壓鍋中121℃高壓30min，滅菌結束后取出自然冷卻；10L及10L以上的生物反應器通常采用在位滅菌的方式滅菌。

3.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型的生產方法，其特征在于：制苗用細胞的接毒采用細胞同步接毒工藝。

4.根據權利要求3所述的豬圓環病毒2型的生產方法，其特征在于：細胞同步接毒工藝為：

（1）采用無支原體和PCV2/PCV1污染的pK-15A1#細胞作為制苗用細胞；

（2）細胞接種到微載體上的密度為2-3×10⁵個/ml；

（3）細胞在生物反應器上培養的條件為：溫度：37.0℃（±0.2℃），pH值：7.40，DO：40%-80%，轉速為40rpm-80rpm；

（4）細胞接毒按照1%-5%（體積比）接種PCV2種毒，接毒后按照之前既定的培養條件繼續培養；

（5）在細胞培養12h時應酌情補加200μmol/L的必須氨基酸；在細胞培養約24h時應換細胞培養用生長液一次；

（6）在細胞培養至約48h時取樣觀察細胞應該長滿微載體約60%-70%，此時應該吸出生長液，加入適量預熱的無菌PBS洗滌兩次并抽出PBS，加入含2%NBCS和1%D-氨基葡萄糖的MEM維持液繼續培養；

（7）維持液培養后約54h后停止攪拌，靜置5min后吸出上清作為一收；

（8）此后加入適量的MEM維持液繼續培養48h，靜置后吸出上清，收獲為二收；

此后加入適量的MEM維持液繼續培養48h，此時將微載體和培養液一起全部收獲，凍融三次后作為抗原保存為三收。