[發(fā)明專利]貉源性成分檢測用引物和探針及其檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310528738.0 | 申請日： | 2013-11-01 |
| 公開（公告）號： | CN103602732A | 公開（公告）日： | 2014-02-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 錢云開;王海洋;高飛;吳曦;王飛;肖艷霞;張會敏;李琳;張進杰;曹彥忠;劉永明;李麗娜 | 申請（專利權(quán)）人： | 秦皇島出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 秦皇島市維信專利事務(wù)所 13102 | 代理人： | 許久利 |
| 地址： | 066004 *** | 國省代碼： | 河北;13 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 貉源性 成分 檢測 引物 探針 及其 方法 | ||
1.一種貉源性成分檢測用引物和探針，其特征在于：
上游引物序列為：5’-TACAGCTGATCTCCTCACGTTAACA-3’；
下游引物序列為：5’-TTGGCCGATGATGATGAAAG-3’；
探針序列為：5’-?AATTGCAGGCCAACCGGTCGAAC-3’，其5’端標記FAM?報告熒光基團，3’端標記TAMRA?淬滅熒光基團。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的貉源性成分檢測用引物和探針進行貉源性成分檢測的方法，其特征在于包括如下步驟：
（1）提取樣品DNA：取吸脂烘干并研磨成細粉的樣品100mg放入2mL離心管中，加入CTAB提取液600μL和20mg/mL的蛋白酶K?10μL，65℃水浴加熱1小時，分別加入Tris飽和酚、氯仿異戊醇各400μL分別搖勻，離心取上清加入1.5mL離心管中，加入該上清量2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置1小時，離心棄上清，先加入氯化鈉水溶液400μL搖勻溶解沉淀，再加入400μL氯仿?lián)u勻，離心取上清，加入新的1.5mL離心管中，加入該離心管中上清量0.8倍體積的異丙醇搖勻靜置1小時，離心棄上清，加入1000μL的70％酒精洗滌，離心，靜置晾干，溶于100μL水中；
（2）進行實時熒光PCR?檢測：實時熒光PCR?檢測的反應(yīng)體系為25μL：包括12.5μL?含有dNTP、Mg2+?以及Taq?酶的2×real?time?PCR?Buffer；所述的上游引物和下游引物各1μL，終濃度各為0.2μM；所述的探針1μL，終濃度為0.2μM；步驟（1）提取的樣品DNA?模板2μL；純水7.5μL；實時熒光PCR?檢測的反應(yīng)程序為：預(yù)變性：溫度95℃，時間10分鐘，然后進行PCR擴增：溫度95℃，時間15秒，溫度60℃時間1分鐘，循環(huán)45?次。
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