[發明專利]一種rPoIFNα1的分離純化方法

在審

• 申請號: 201310526225.6
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103965346A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 王明麗;趙俊;何磊
• 申請（專利權）人: 王明麗;趙俊
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及藥用干擾素蛋白的純化，特別適用于工程菌發酵得到的帶his-tag標記基因工程重組干擾素規模化生產過程中的蛋白質分離純化。

背景技術

干擾素（interferon，IFN）是由病毒或其他干擾素誘導劑刺激機體后產生的一種小分子量糖蛋白，具有廣譜地抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等功能，根據來源等不同，可分IFN-α，IFN-β，IFN-γ三種。其中IFN-α可刺激機體產生抗病毒蛋白質，且具有廣譜的抗病毒作用。重組人IFN-α已廣泛用于臨床，治療各種病毒性疾病，其療效已被各國學者所公認，但動物干擾素的臨床應用卻相對緩慢。

我國是世界上養豬大國，豬的疾病種類繁多，特別是病毒性傳染病造成的發病率和死亡率最高，每年給養豬業造成巨大的經濟損失，有些病毒性疾病還威脅到人類健康。因此具有良好抗病毒作用的重組豬干擾素，不僅對我國養豬業的健康發展有重要意義，也為人類的生命健康提供了重要保障。

本課題組采用基因工程原核表達技術，已成功構建出可高效、穩定表達具有高活性rPoIFNα1的E.coli BL21工程菌（重組豬α干擾素的制備方法，專利號2008100201804），具有工藝流程短、生產成本低等優點。應用此工程菌進行高密度發酵后的純化目的蛋白是一道非常重要的工藝過程：即將rPoIFNα1從復雜的細菌表達環境中提取出來，去除各種雜質，包括顆粒、細菌、內毒素、核酸和各種雜蛋白等非目標蛋白物，以達到政府藥品監督管理部門對該種生物制品要求的各項質量標準，才能滿足臨床需求。

目前國內外有一些對重組豬干擾素分離純化報道，但其重組豬干擾素制備工藝各不相同，因此生產過程中蛋白質純化工藝也完全不同。中國專利（CN 101570757A）構建的豬α干擾素/白細胞介素2融合蛋白是以包涵體形式表達，采用包涵體變性復性的方法初步純化豬α干擾素/白細胞介素2融合蛋白，該純化工藝尚達不到生物制品生產要求；中國專利（CN 102732587A）采用真核載體構建表達重組豬干擾素α，該工藝生產周期較長，規模化生產成本高。因此探索建立本課題構建的rPoIFNα1蛋白規模化生產分離純化工藝，具有重要的理論意義和實踐價值。

目前，利用重組工程菌株表達生產級用生物制品，在后期的分離純化過程中一般都要使用價值昂貴的單克隆抗體親和層析純化柱，純度才能達到95%以上。而本室自行構建的工程菌所表達的rPoIFNα1，市場上并無對應的單克隆抗體親和層析純化柱可供用于純化。因此，自行建立一種經濟、快速和高效的純化方法，以得到高純度的rPoIFNα1，尤為重要。

本發明采用了包括鎳離子螯合層析、強陽離子交換層析、強陰離子交換層析三步層析方法，大幅度地提高了rPoIFNα1的純度（純度高達98.8%）。

發明內容

本發明目的就是為了提供一種rPoIFNα1的分離純化方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種rPoIFNα1的分離純化方法，包括以下步驟：

（1）金屬螯合層析；

（2）強陽離子交換層析；

（3）強陰離子交換層析。

所述的金屬螯合層析為鎳離子螯合層析，平衡液是含5~45mM咪唑的磷酸鹽緩沖液；

強陽離子交換層析所用純化柱是SP Sepharose FF，平衡液是pH4.0~6.0的醋酸鹽緩沖液；

陰離子交換層析所用純化柱是Q Sepharose FF，平衡液是含0~25mM氯化鈉的緩沖液。

本發明的優點是：

使用本發明提供的純化方法，得到的rPoIFNα1蛋白純度高達98.8%，達到生物制品注射用重組干擾素質量標準要求，適合規模化生產用。

附圖說明

圖1 rPoIFNα1蛋白層析純化色譜圖;

圖1 A: rPoIFNα1蛋白親和層析色譜圖，其中縱坐標mAu表示A280紫外吸收值，橫坐標為體積;

圖1 B: rPoIFNα1蛋白陽離子交換層析色譜圖，其中縱坐標mAu表示A280紫外吸收值，橫坐標為體積;

圖1 C: rPoIFNα1蛋白陰離子交換層析色譜圖，其中縱坐標mAu表示A280紫外吸收值，橫坐標為體積;

圖2rPoIFNα1純化蛋白Western blot 檢測結果

M：蛋白質分子量Marker；

泳道1：rPoIFNα1蛋白純化后結果；

泳道2：rPoIFNα1蛋白純化前對照；

泳道3：BL21工程菌蛋白對照。