[發明專利]一種檢測重組豬干擾素α1凍干粉針劑中細菌內毒素含量的方法

有效

• 申請號: 201310526221.8
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103592442A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 王明麗;趙俊;葉靚;周煒
• 申請（專利權）人: 王明麗;趙俊
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術領域

本發明屬于微生物領域，涉及一種生物制品的細菌內毒素含量檢測方法，具體涉及一種重組豬干擾素α1凍干粉針劑中細菌內毒素含量的檢測方法。

背景技術

干擾素作為當前公認的抗病毒有效藥物，安全性能好，并具有良好的抗病毒及免疫調節功能，是當今應用前景最為廣泛的生物制劑之一。動物用干擾素最早應用于獸醫臨床的是豬白細胞干擾素，但該種干擾素表達量低，需采用生化分離的方法獲得，成本較高，不利于規模化生產。我室采用基因工程技術獲得了一種重組豬干擾素ɑ（重組豬α干擾素的制備方法，專利號2008100201804），臨床試用結果表明其可有效治療豬病毒性腹瀉等疾病。

細菌內毒素是一種革蘭陰性細菌細胞壁的組成成分，只有在細菌死亡或繁殖時，才釋放到細胞外，發揮各種效應。內毒素化學本質為脂多糖（LPS）。細菌內毒素檢查法是近二十年來發展起來的用于檢測藥品及其中間品中內毒素污染的一種方法。傳統的細菌內毒素檢查法是家兔熱原檢查。2005年版《中國藥典》參照美、歐、日三方關于細菌內毒素檢查法協調案的格式,并結合國內實際情況,確定了鱟試驗法做為檢測人基因工程干擾素制劑細菌內毒素含量的標準檢測方法。本法與傳統家兔法比較具有靈敏度高，無個體差異，受外界影響小，實驗重現性好，費用低廉等優點，非常適合廠家對生產全過程的熱原監控和中間產品檢測。但是目前獸用生物制品現行的細菌內毒素檢查法依然是傳統的家兔熱原檢查，因此建立獸用生物制品中新的細菌內毒素含量檢測方法具有重要的意義。

發明內容

本發明目的就是提供一種重組豬干擾素α1凍干粉針劑中細菌內毒素含量的檢測方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種檢測重組豬干擾素α1凍干粉針劑中細菌內毒素含量的方法，采用改良鱟試劑檢查法，包括以下步驟：

用2ml細菌內毒素檢查用水溶解重組豬干擾素α1凍干粉針劑，100℃煮沸10min去除鱟試驗干擾因素，用細菌內毒素檢查用水在不超過最大有效倍數的情況下對煮沸處理后重組豬干擾素α1蛋白進行逐級稀釋，先檢查各稀釋濃度的細菌內毒素含量，然后再從反應結果為陰性的最低稀釋度開始做干擾試驗，找出在無干擾的情況下能與鱟試驗形成凝膠的最低濃度，從而確定重組豬干擾素α1凍干粉針劑中內毒素的具體含量。

本發明的優點是：

可以快速地檢測出重組豬干擾素α1凍干粉針劑中的細菌內毒素含量。

采用加熱法去除了干擾因素，檢測結果準確可靠。

操作簡便，無需貴重精密的大型的設備，檢測成本低。

具體實施方式

實施例1

1.試劑

供試品：重組豬干擾素α1凍干粉針劑（批號是20121116，效價為1.0×10⁶IU，內毒素含量為25EU）

細菌內毒素檢查用水：內毒素含量小于0.015EU/ml且對內毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水

細菌內毒素國家標準品：購自中國食品藥品檢定研究院，每支10000EU。

鱟試劑：購自廈門鱟試劑廠，0.1ml/支（λ=0.25EU/ml）

2.儀器設備

旋渦混合器、封口膜、試管（10×75mm）、吸管、鑷子（金屬）、金屬盒。

實驗中使用的所有玻璃器具一般經洗液浸泡后，取出用自來水、純化水依次沖洗干凈（可用純化水浸泡）。

試驗中所用的器皿，需要經過250℃干烤30分鐘以上備用，以除去外源性內毒素。除去外源性內毒素的玻璃器皿應在規定內使用（如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內使用），否則須再次除去可能存在的外源性內毒素。

3.確定細菌內毒素限值

公式L=K/M計算。M為每公斤每小時臨床最大用藥劑量，依據藥品使用說明書確定，注射時間若不足1小時，按1小時計算。K為每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5EU/(kg·h)

本室重組豬干擾素α1凍干粉針劑按效價計算：每公斤每小時臨床最大用重組豬干擾素α1凍干粉針劑劑量1000IU（20公斤乳豬20000IU干擾素），L為5EU/2000IU=0.0025EU/IU，每支重組豬干擾素α凍干成品20000IU，則每支重組豬干擾素α1凍干粉針劑內毒素限值為50EU。

4.確定最大有效稀釋倍數（MVD）