[發明專利]栽培黑麥籽粒Waxy蛋白亞基及其提取、鑒定方法和編碼基因與應用

無效

• 申請號: 201310525936.1
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103554239A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 高翔;陳其皎;董劍;孟敏;趙萬春
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/11;A01H5/00;C07K1/14;G01N33/68;C07K1/18
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.栽培黑麥的黑麥籽粒Waxy蛋白亞基，具有序列表1所示的氨基酸排列順序。

2.權利要求1所述蛋白的編碼基因，其特征在于具有序列表2所示的核苷酸序列；或與序列表2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。

3.擴增權利要求2所述編碼基因的引物對。

4.根據權利要求3所述的引物對，其特征在于表達引物的序列為WxexpF：5’-ATGAACCTCGTGTTCGTCGGC-3’，WxexpR：5’-TCAGGGAGCGGCGACG-3’。

5.權利要求1所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基在調節禾谷類籽粒直鏈淀粉合成酶與調節禾谷類籽粒直鏈淀粉含量的應用。

6.權利要求2所述編碼基因的表達方法，其特征在于首先采用PCR方法擴增栽培黑麥Waxy基因完整編碼序列，將所得擴增產物回收目的片段，與載體連接并轉化大腸桿菌，在LB平板上37℃過夜培養，利用測序引物進行陽性篩選并測序；利用權利要求5的引物對擴增陽性質粒，將回收片段克隆至表達載體并轉化，將所得陽性菌株誘導后離心收集菌體即得。

7.權利要求1所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的提取分離方法，其特征在于采用多籽粒提取，去除懸濁液中的面筋和種皮，然后將粗淀粉加入上樣緩沖液后高溫水浴和沸煮，離心取上清液；將從籽粒中提取的Waxy蛋白粗提液加載到DuoFlow蛋白純化系統，收集目標洗脫組分供質譜測序及SDS-PAGE檢測。

8.根據權利要求7所述的提取方法，其特征在于所述高溫水浴條件為80℃、30min水浴。

9.根據權利要求7所述的提取方法，其特征在于所述Waxy蛋白粗提液采用DuoFlow?UNO?Q1陽離子交換柱，其中掛柱緩沖液為低濃度Tris-Hcl(20mM?Tris-Hcl，pH9.5)，蛋白洗脫液為高濃度NaCl：20mM?Tris+1M?NaCl，pH9.5；在280、260、214或200nm波段進行檢測。

10.權利要求1所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的鑒定方法，其特征在于采用CE鑒定方法，以DuoFlow純化產物為標準樣，以0.05mM硼砂+15％乙腈+1％SDS溶液(pH9.5)為緩沖液，采用分離電壓20kV，溫度25℃，檢測波長214nm，壓力進樣，0.5psi×5s。