[發明專利]瓠瓜抗病毒病基因片段或基因標記及應用

在審

• 申請號: 201310524812.1
• 申請日: 2013-10-28
• 公開（公告）號: CN104561029A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 錢孝英;錢春桃
• 申請（專利權）人: 常熟市智林蔬果專業合作社
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明是利用抗病基因同源序列法，克隆瓠瓜抗病毒病基因片段或者將其轉化為分子標記等，主要涉及瓠瓜常規雜交育種，分子標記輔助育種，抗病毒病基因的定位和分子作圖，抗病毒病基因的克隆以及抗病基因的調控機理分析等方面，屬于植物生物技術科學領域。

背景技術

瓠瓜是長江中下游重要的蔬菜作物之一。病毒病是瓠瓜生產上最重要的病害。主要在定植初期發病，造成植株矮小，葉片皺縮，植株無法正常生長，嚴重時后期葉片枯黃或死亡。成株期發病，葉片上呈現深綠色和淺綠色斑駁，往往植株頂部連續幾張新葉發病，造成植株生長緩慢。重病株上部葉片畸形皺縮，病株結瓜數減少，瓜面出現黑色小斑點且畸形，失去商品性。主要表現為：①花葉型：在新抽的幼葉上癥狀最為明顯，老熟葉片癥狀不明顯，主要表現為在新葉上出現黃綠相間的花葉癥狀，葉片成熟后變小、皺縮、邊緣卷曲。在果實上表現為瓜條出現深淺綠色相間的花斑，染病后瓜條生長緩慢甚至停止，畸形。發病嚴重時，植株矮小，莖節間縮短，使植株萎蔫。②皺葉型：多出現在成株期，葉片出現皺縮，產生暗綠色斑駁隆起，邊緣難于開展，同時葉片變厚、葉色變濃，引起植株矮化。③蕨葉型：黃瓜植株生長點新葉無法正常開展，而后變細皺縮成蕨葉狀，葉緣向內卷曲，多變成雞爪狀，植株生長點受到嚴重抑制，達不到正常的生長高度。病毒病影響了瓠瓜植株的正常的生長發育過程，給生產帶來極大的經濟損失。抗病基因的利用及抗病育種是瓠瓜病害防治最有效的方法。

二十世紀四十年代，Flor提出了經典的“基因對基因”理論模型，即植物和病原菌體內各自存在一個顯性基因，植物抗病基因或病菌無毒性(Avr)基因的缺失或改變都能引起病害的產生。這個模型適用于大多數活體營養型病原菌，包括病毒、細菌、真菌和線蟲類。“基因對基因”抗病性一般是受體被作為模型：植物抗病蛋白能夠直接或間接的識別源自病菌的Avr產物。一旦這種識別發生，就會引起防御反應。大多數抗病基因(Resistance?gene；R)觸發的抗性與快速防御反應相關，稱為過敏性反應(hypersensitive?response；HR)。而目前，大多數抗病基因的產物都含有蛋白識別的結構域，如富含亮氨酸的重復單位(LRR)的結構域或卷曲螺旋(CC)的結構域；信號轉導結構域，如核苷酸結合部位(NBS)或蛋白激酶(PK)結構域。一些抗病基因產物被預測為細胞質蛋白，而另一些通過一個跨膜結構域(TM)貫穿細胞膜。這些結構域組合能夠產生不同類型的R蛋白。根據結構的特性已經鑒定出至少六種不同類型的R基因：1)NBS-LRR，2)LRR-TM-PK，3)LRR-TM，4)CC-TM，5)PK，6)PK-PK。其中，NBS-LRR類抗病基因是植物體內存在的最大一類抗病基因；這些抗病基因在結構上的保守性為我們利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因帶來了潛在可能。在已知分離獲得的抗病基因中，小麥抗葉銹病基因Lr10和馬鈴薯抗馬鈴薯X病毒基因Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的經典例子，說明利用該法克隆抗病基因是可行的。

發明內容

技術問題

本發明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鑒定瓠瓜病毒病基因片段或者將其轉化為分子標記。結果一方面可用于瓠瓜抗病毒病分子標記輔助選擇育種，另一方面也為抗病毒病基因的克隆提供參考依據。

技術方案

本發明前期對大量瓠瓜種質資源進行抗病性篩選，在獲得1份高抗瓠瓜病毒病抗病種質的基礎上，應用抗病基因同源序列法克隆抗病毒病基因片段，通過與已知抗病基因同源性及序列比對分析等方法確認；為開發相應的分子標記和利用cDNA末端快速擴增技術獲得抗病基因的全長奠定基礎。

為了實現上述目標，本發明采用抗病基因同源序列法對瓠瓜抗病毒病基因進行克隆，獲得了抗病毒病基因片段或者基因標記3個，片段大小分別為510bp，510bp和504bp。以該基因片段序列為基礎，開發相應的分子標記，可以進行瓠瓜抗病毒病分子標記輔助選擇育種；同時利用基因片段或者基因標記進行新的種質資源的創新；結合已有的分子標記可以實現瓠瓜抗病毒病基因的分子作圖；利用這些基因片段，通過設計基因特異引物，采用cDNA末端快速擴增技術分離瓠瓜抗病毒病基因，為通過基因工程改良瓠瓜的抗病性奠定基礎；也為最終解析瓠瓜抗病毒病基因的分子機理提供了基因資源。

本發明的積極效果：

1)有利于快速開發與抗病基因緊密連鎖的分子標記。通過鑒定的瓠瓜病毒病基因，開發相應的共分離功能性標記(SNP、SCAR等)，可以快速的用于抗病基因的分子標記輔助選擇，準確性高。