[發明專利]液相片段縮合制備胸腺肽α1的方法

有效

• 申請號: 201310523577.6
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103665144A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 王銳;常民;彭雅麗;薛宏祥;李明生
• 申請（專利權）人: 江蘇施美康藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/06;C07K1/02
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 張英荷

技術領域

本發明屬于生化技術領域，涉及一種胸腺肽α1的合成方法，尤其涉及一種液相片段縮合制備胸腺肽α1的方法。?

背景技術

胸腺肽α1(又稱胸腺素α1、胸腺法新)是一種具有下式結構的胸腺肽：Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。胸腺肽α1是哺乳動物胸腺中存在的單一組分的多肽化合物，是由28個氨基酸殘基和N端氨基酸乙酰化構成的多肽，是與免疫細胞發育分化相關的分子，具有使T淋巴細胞分化、增殖、提高細胞免疫功能的作用，能破壞被感染的靶細胞，還可激活NK細胞活性，促進與免疫相關的細胞因子的產生。胸腺肽α1的活性較胸腺五肽高10到1000倍，是復合治療慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷綜合癥藥物，在非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤治療中也發揮了較大的作用。胸腺肽α1于1997年由意大利賽生(Sciclone)公司開發上市，現己被24個國家批準用于慢性乙型肝炎(HBV)的治療，在歐美日等國也用于治療丙型肝炎(HCV)、肝細胞癌及增強免疫疾病的治療。?

???1983年公開的美國專利US4504415使用全液相合成胸腺肽α1。最近的胸腺肽α1及其類似物的制備方法主要有兩種，其中一種是采用生物合成技術，在2003年1月1日公開的中國發明專利(CN1388133A)中，利用人工基因合成技術獲得胸腺肽α1的全序列。另一種為固相合成方法，“化學學報”2004年第55卷第2期《胸腺素α1的DIC固相化學合成與鑒定》中提到，以Wang?Resin為起始原料，通過激活試劑DIC+HOBt將Fmoc-Asn(Trt)-OH與樹脂相連接；“天津藥學”2001年6月第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α1及其反應途徑》中提到，以HMP樹脂為起始原料，通過激活試劑DCC+?HOBt將Fmoc-Asn(Trt)-OH與樹脂相連接。中國專利CN200610024610.0、CN200680014615.3、CN200710024406.3、CN200780024724.8、CN201110069876.8均為固相合成胸腺肽α1。?

綜合參考國內外關于胸腺肽α1制備方法以及相關的合成報道文獻，發現這些技術都存在一些不足，主要表現在：①全液相合成費時，需要良好的后處理技術；②生物合成技術難以規模化生產；③常規固相合成方法難以獲得高純度的胸腺肽α1，而且收率低（5~10%），導致生產成本高。?

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種液相片段縮合制備胸腺肽α1的方法。?

本發明液相片段縮合制備胸腺肽α1的方法，包括在固相支持體上合成胸腺肽α1的側鏈保護肽片段，在液相中縮合側鏈保護肽片段，形成保護的胸腺肽α1，然后將側鏈和羧基端去保護，獲得目的肽。其具體制備工藝如下：?

（1）將結構為Fmoc-EVVEEAEN-COOH的側鏈保護肽羧基端進行保護，得到結構為Fmoc-EVVEEAEN-Y的側鏈保護肽片段，并使該肽片段的氨基端去保護，得到結構為NH₂-EVVEEAEN-Y的側鏈保護肽；

（2）采用液相片段縮合方法，將側鏈保護肽NH₂-EVVEEAEN-Y與結構為Fmoc-KEKK-COOH的側鏈保護肽反應，得結構為Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保護的側鏈保護肽；并使該肽片段的氨基端去保護，得NH₂-KEKKEVVEEAEN-Y；

（3）將Fmoc-EITTKD-COOH側鏈保護肽與Leu-OBzl反應得到側鏈保護肽Fmoc-EITTKDL-OBzl，并將氨基Fmoc脫去，得到側鏈保護肽NH₂-EITTKDL-OBzl，再采用液相片段縮合法將NH₂-EITTKDL-OBzl側鏈保護肽與結構為Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的側鏈保護肽縮合，產生結構為側鏈保護肽Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl；再將肽氨基末端乙酰化，得側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl，并脫去羧基端Bzl保護，得到Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH；

或將側鏈保護肽NH₂-EITTKDL-OBzl與側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSS-COOH縮合得到側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl，并脫去羧基端Bzl保護，得到側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH；