[發明專利]一種檢測痕量酚類環境雌激素的方法

有效

• 申請號: 201310522774.6
• 申請日: 2013-10-28
• 公開（公告）號: CN103558305A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 王慧利;王學東;王永魁
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/14;G01N30/06
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明具體涉及一種檢測痕量酚類環境雌激素的方法，屬于生物樣品和環境檢（監）測技術領域。

背景技術

酚類環境雌激素是環境中最常見的一類具有雌激素活性的污染物。大量環境調查結果和實驗室研究表明酚類環境雌激素如雙酚A、五氯酚和雌二醇等對近年來男性睪丸癌和前列腺癌發病率的上升、精子數量的減少、女性乳腺癌、子宮癌發病率的增加、雄性動物的雌性化和免疫功能的改變等均具有不容忽視的作用。故酚類環境雌激素（PEs）已成為近年來重點研究和監測的熱點污染物。目前，美國、日本和歐洲等國家已對水體中部分酚類環境雌激素的最大殘留限量作了規定，一般在0.1μg/L甚至更低的水平。然而，目前的研究結果表明：該類污染物在更低的水平下，仍然能夠對生物產生雌激素效應。因此，建立該類化合物在生物體內的劑量—響應曲線，并確定其表現雌激素活性的閾值至關重要。為此，必須盡快建立具有極高靈敏度和選擇性的定性和定量分析方法。

目前已有的萃取技術絕大多數還是依賴于液液萃取或固相萃取進行分離和富集，操作過程比較繁瑣，有機溶劑揮發污染嚴重，檢測費用較高。且現有的微萃取技術所使用的萃取劑和分散劑仍存在一定的毒性和污染問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測痕量酚類環境雌激素的方法。

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：

一種檢測痕量酚類環境雌激素的方法，主要包括提取和檢測兩個步驟，所述的提取包括以下步驟：調節待測溶液的pH值為2.5～3.5（以利于提高微萃取回收率），加入表面活性劑和萃取劑，超聲混勻，再低溫離心，棄去上層即可。

所述的酚類環境雌激素為雙酚A（BPA）、17α-雌二醇（17α-Estradiol）、4-叔丁基酚（4-BP）、4溴雙酚A（4-Br-BPA）和/或4-叔辛基酚（4-t-OP）。

所述的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）或吐溫，如吐溫20。優選十二烷基硫酸鈉。

所述的萃取劑為氯苯（C₆H₅Cl）、四氯甲烷（CCl₄）或三氯甲烷（CHCl₃）。優選三氯甲烷。

所述超聲的功率為350～450W，開關間隔為5s:3s（即開5s關3s），共計40～60次。優選50次。

所述低溫離心的溫度為0～4℃，轉速為4000～6000rpm，時間為2～5min。優選的，低溫超速離心的溫度為4℃，轉速為5000rpm，時間為2min。

所述的檢測包括如下步驟：將提取得到的溶液用高效液相色譜儀進行定量檢測，流動相為乙腈和去離子水，梯度洗脫條件為：0～6min，乙腈:水=45:55；6～20min，乙腈:水=70:30；柱溫為25℃，紫外波長為270nm，流速為0.8mL/min，進樣量為20μL。

一般的，在提取步驟之前，針對不同的樣品其前處理步驟存在差異，比如生物樣品、環境樣品、食品或藥品等。

當檢測對象為生物樣品（如螺旋藻細胞）中酚類環境雌激素殘留時，需要對生物樣品進行清洗、破碎和凈化處理，具體包括如下步驟：（1）清洗生物樣品去除培養基及部分代謝產物，超聲破碎；（2）在超聲破碎后的樣品中加入濃硫酸凈化，靜置，離心，取上清液備用。即采用濃硫酸磺化法凈化螺旋藻破碎細胞中如蛋白質、脂質等大分子物質，超聲破碎后樣品與濃硫酸的體積比為100:3。該上清液即為待測溶液。

所述步驟（1）中采用離心法清洗生物樣品，即將生物樣品離心取沉淀（生物樣品加水后離心或生物樣品本身即為懸浮液），在沉淀中加水再次離心，重復上述步驟，最后棄去上清液即可。

所述步驟（1）中超聲破碎之前先在沉淀中加入適量的水，混勻后備用。對于螺旋藻細胞懸浮液，優選的，超聲破碎的功率為350～450W，開關間隔為5s:3s，開關間隔次數為30次，共計50～60次。

所述步驟（2）靜置的時間為2～5min，優選2min。超速離心的轉速為4000～6000rpm，時間為2～5min，優選轉速為5000rpm，時間為2min。

當檢測對象為環境樣品（如水樣）中痕量的酚類環境雌激素時，需要對水樣進行過濾除雜操作（如過0.22μm的濾膜除雜），濾液即為待測溶液；或者在濾液中加入濃硫酸凈化，靜置，離心，取上清液備用，該上清液即為待測溶液。