[發明專利]一株能降解海水柴油污染物的基因工程細菌Y8-alkB2

無效

• 申請號: 201310522030.4
• 申請日: 2014-01-03
• 公開（公告）號: CN104031871A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 劉瓊;何穎;沈先榮;李珂嫻;王慶蓉;侯登勇;蔣定文;劉玉明;陳偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍醫學研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12R1/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1技術領域

本發明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制備、鑒定及其降解能力的測定。

2背景技術

微生物降解是去除環境中石油污染物的主要途徑。生物修復是指利用生物特別是微生物來催化降解環境污染物，減小或最終消除環境污染的受控或自發過程，是在微生物降解基礎上發展起來的新興的環保技術。

土著微生物降解污染物的潛力巨大，但馴化時間長、生長速度慢、代謝活性低，因而轉入外源高效污染物降解基因，能夠提高生物修復效率。近年來，構建高效的基因工程菌以顯著提高污染物的降解效率成為油類污染治理的一個熱點，它為解決生物修復周期長等問題提供了嶄新的途徑。國外學者Charkrabany經過研究發現能降解芳烴、萜烴、多環芳烴的細菌的降解基因位于質粒上，他根據質粒容易傳遞的特性將能夠降解脂(含質粒A)的一種假單胞菌作為受體細胞，分別將能夠降解芳烴(含質粒B)、萜烴(含質粒C)、多環芳烴(含質粒D)的質粒，用遺傳工程的方法人工轉入受體細胞，獲得多質粒的“超級細菌”，這一新型菌能同時降解四種石油組分，能把原油中約2／3的烴類消耗。它的突出優點是比自然菌降解速度快。所以，本研究著重選取恰當的基因，構建基因工程菌，以期解決土著菌降解效率低的難題。

烷烴降解菌的降解酶基因以烷烴末端但加氧酶AlkB相關的烷烴羥化酶為目前的研究熱點。烷烴進入細菌后，先被細胞膜上的AlkB蛋白進行末端羥基化，然后在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的作用下進一步氧化，最后加上乙酰輔酶A，進入β氧化循環，分解成二氧化碳和水，AlkB酶是烷烴降解的限速酶。

某些微生物能以烷烴為碳源已被公認，但大多數生化和遺傳研究主要還是集中在有限的幾個原型系統，Alcanivorax?borkumensis烷烴羥化酶系統是其中之一，Alcanivorax?borkumensis是海洋微生物中一種獨特的、以烷烴為主要的特異性底物生長的桿狀γ-蛋白菌。該菌遍布全球眾多海域，包括太平洋、地中海、日本海、中國沿海和北極。在沒有污染的海洋中，該菌數量很少，但在石油污染的開發海域或海岸，該菌可快速生長成為污染水域中的優勢菌群，在石油降解菌群中，該菌所占比例為80-90％。近期研究報道證明A.borkumensis在石油污染生物修復中發揮關鍵作用。2006年，Nature?Biotechnology報道了A.borku-mensis?SK2的基因組全長序列及其功能分析結果，發現該菌基因組中含有多個編碼烴類物質分解代謝酶系統的基因簇，如alkSBlGJH基因簇，gntR和alkB2，p450等。這些基因編碼的蛋白在n-烷烴轉變成脂肪酸的過程中發揮重要作用，其中alkB2編碼的烷烴羥化酶是不含血紅素鐵的膜蛋白，其催化的烷烴羥化反應是烷烴降解作用過程中的第一步也是關鍵步驟，其烷烴降解的范圍是C8-C16。因此，我們選擇A.borku-mensis?SK2的alkB2基因為目的基因。

3發明內容

本發明的目的是制備一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌，并鑒定其降解能力。

Y8菌是從定海港口受污染的海水中，采用富集培養微生物的方法，分離獲得的對油類污染降解效率較低的土著菌，但能在以柴油為唯一碳源的海水培養基中生長繁殖。經紫外分光光度法檢測，其對柴油污染物的7天降解效率僅為10～15％。

對Y8菌株直接進行菌落PCR擴增，得到16S?rDNA的基因序列，構建系統發育樹，結果表明Y8菌株與Klebsiella?oxytoca?strain?ATCC13182相似度達到99％，由此可確定該菌株屬于克雷伯氏菌，重建的系統發生樹表明Y8與Klebsiella?oxytoca?strain?ATCC13182所構的支為姐妹群關系。

提取Y8基因組，經PCR分析得知Y8中未含有烷烴羥化酶AlkB2，由于烷烴羥化酶是柴油降解的重要限速酶，所以采用基因轉導的方法，在Y8中轉入alkB2基因，構建基因工程菌Y8-alkB2。

經鑒定Y8-alkB2能特異表達AlkB2蛋白，對柴油的降解率分別為：2天，20.14％；4天，51.94％以及6天，72.16％。

4附圖說明

圖1：根據Y816s?rDNA序列構建的系統發育樹。

圖2：PCR鑒定Y8中alkB2基因表達：P-質粒；G-基因組。

圖3：pCom8-alkB2質粒的鑒定(質粒大小、PCR和酶切)

圖4：Y8-alkB2菌株抽提質粒PCR、酶切鑒定以及蛋白表達鑒定的鑒定。

圖5：Y8與Y8-alkB2菌株對柴油的降解效率比較。