[發明專利]一種基于分段收集的親和核酸分子的篩選方法

無效

• 申請號: 201310521470.8
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103525820A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 羅昭鋒;周宏敏;王潔;歐惠超;張海燕
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 陳曉娜

技術領域

本發明屬于一種篩選分離方法，特別是從一個混合的核酸分子庫中篩選并分離出具有某種特性的分子的方法。

背景技術

核酸適配體是一類能夠與小分子、蛋白、細菌和細胞等多種靶標結合的單鏈DNA或者RNA分子，由于性質類似抗體，并且相對抗體而言具有多種優勢：靶標廣泛、分子量小、生產容易、質控簡單、應用廣泛、存儲和運輸方便等，因此受到廣泛的重視。篩選獲得適配體的技術被稱作SELEX(Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment)技術。但如何獲得適配體一直是適配體廣泛應用的瓶頸。毛細管電泳(Capillary?Electrophoresis，CE)技術因其高效的分離效率和微量的樣品用量，在篩選核酸適配體時效率明顯遠遠高于其它技術。利用毛細管電泳篩選核酸適配體的技術稱為CE-SELEX技術。2004年Mendonsa，S.D.(JACS.126，20-21，2004)報道毛細管電泳技術可以在3-4輪篩選而獲得適配體。2006年，Berezovski，M.(JACS.128，1410-1411，2006)報道的NON-SELEX技術，連續分離三次，即可篩選出高親和力的核酸適配體。2012年，新加坡國立大學化學系的Li?SF實驗室也報道利用NON-SELEX技術篩選出牛過氧化氫酶的適配體。盡管這些技術可以快速獲得核酸適配體，但迄今為止，NON-SELEX只有少數幾篇文獻報道。CE-SELEX盡管報道的相對較多，但實際研究中發現，仍存在不少問題，成功的實例明顯少于磁珠法篩選。

在常規的CE-SELEX技術中，一般是摸索一個分離條件，該條件必須能夠將靶分子和隨機的DNA文庫或RNA文庫很好地分開。實際篩選時將靶分子與待篩選的文庫混合，在兩者之間可能存在復合物的區域進行收集。由于復合物準確的位置是未知的，所以收集時需要收集較寬的窗口，這樣會導致收集物中有一些并非結合的復合物，而是游離的文庫分子，從而導致篩選效率降低。NON-SELEX技術通過連續多次收集來減少收集到非結合分子的概率。該方法由于實際使用的庫容很小，且反復收集容易導致污染，使得該方法的成功率極低。

發明內容

本發明的目的就是建立一種從隨機的核酸文庫中快速高效地分離與靶分子高親和性結合的核酸分子的方法。

本發明的方法包括下述步驟：

(1)將靶分子與待篩選的文庫混合后，通過毛細管電泳或者色譜技術分離，特征是在收集復合物時分成多段進行分段收集，然后將所有收集的樣品分別進行熒光定量PCR擴增；

(2)根據熒光定量PCR擴增的結果，可以判斷不同收集組分中模板量的多少，從而確定復合物峰所在的位置；

(3)將出現復合物峰的管中的收集產物進行放大擴增，制備得到富集的文庫，可以直接進行親和力測試或者重復進行下一輪篩選，直到測得的親和力達到預期為止。

本發明可以用于篩選高親和力的核酸適配體，也可以用于篩選啟動子結合序列。

本發明初始使用的文庫，可以是單鏈的DNA文庫分子、雙鏈的DNA文庫分子，或者是RNA文庫分子。文庫分子類型不同，制備富集后的文庫分子所用的方法略有不同：如果原始的樣品是單鏈DNA，得到PCR產物后，需要經過單鏈制備步驟；如果原始樣品是RNA，還需要經過轉錄步驟；如果原始核酸是雙鏈DNA，通常只需經過純化即可；

上面所說的分段收集，可以分成兩段以上；具體分成多少段進行收集，本領域技術人員可以根據分離的效率和操作的便捷性和對污染的控制能力來確定；通常可以選擇在預定收集區域分成5-15段進行收集。

本發明中盡管并未直接測試利用液相色譜技術和毛細管電色譜等分離技術結合分段收集來進行篩選，但通過類比分析知道，結合分段收集，同樣可以提高這些技術在篩選親和核酸分子方面的效率。

綜上所述，本發明提供下述：

1.一種快速分離與靶分子高親和性結合的核酸分子的方法，所述方法包括：將所述靶分子與待篩選的文庫分子混合后，通過毛細管電泳或者色譜技術分離，特征是在收集復合物時分成多段進行分段收集，然后將分段收集的多份樣品分別進行熒光定量PCR擴增；通過熒光定量PCR的方法確定所述靶分子與靶核酸分子所形成的復合物所在的位置，從而快速獲得與靶分子高親和性結合的靶核酸分子。

2.根據第1項所述的方法，其中所述分段收集是分成兩段以上進行收集。

3.根據第1項所述的方法，所選用的文庫分子是單鏈DNA文庫分子、雙鏈DNA文庫分子或RNA文庫分子。