[發明專利]具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列

有效

• 申請號: 201310521130.5
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103525845A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 鞠吉雨
• 申請（專利權）人: 濰坊醫學院
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/64;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種海蚯蚓蛋白酶，具體地說是一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列，屬于醫藥生物工程領域。

背景技術

?蚯蚓，又名地龍，作為中國傳統藥物已應用2000多年。蚯蚓具有活血化瘀、清熱解毒、提高機體免疫功能的作用，長期以來可用于細菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病的治療。近年來蚯蚓提取物的抑制血小板凝聚、溶解血栓的作用使其用于心血管疾病的臨床治療。另外，從蚯蚓中還提取到抗腫瘤活性的物質，多為蛋白酶組分，它能抑制腫瘤細胞生長，并且作為生物反應調節劑，具有輻射增效和化學增效作用。實驗及臨床研究證明蚯蚓提取物可以從多個方面抑制腫瘤的發生發展，有望成為新型抗腫瘤藥物．

海洋生物海蚯蚓(Arenicola?cristata)與蚯蚓同屬于環節動物門，但綱目科不同。海蚯蚓為多毛綱小頭蟲目沙蠾科，形似蚯蚓，生活于潮間帶多沙地帶，營管居生活，故名海蚯蚓，主要分布于我國渤海、黃海沿岸。海蚯蚓始載于《中國藥用動物志》，用于癰瘡腫毒，有清熱解毒之功效。目前對海蚯蚓的研究方向主要集中在其形態結構、生理代謝、營養成分分析等方面。根據蚯蚓目前的研究狀況，我們推測在海蚯蚓體內也存在多種蛋白酶，充分研究這些蛋白酶具有廣闊的應用前景。但除了我們實驗室報道了一個基因序列（ZL201210236225.8）外，尚沒有其他海蚯蚓蛋白酶新基因序列的報道。我們對已報道的環節動物門蚯蚓（Eisenia?fetida?DQ836917.1、Eisenia?fetidaDQ418454.1、Lumbricus?rubellus?U25647.1）和單環刺螠（Urechis?unicinctus?HM623463.1）cDNA序列進行多重比對，采用同源序列克隆法，通過3′RACE、5′RACE技術，獲得了一種編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。

發明內容

本發明提供一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。

為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：

以來自海蚯蚓消化道上皮細胞的mRNA為模板，采用同源序列克隆法，通過3′RACE、5′RACE技術，獲得了一種編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。將該序列表達活性肽的部分克隆到表達載體上，在原核表達系統大腸桿菌中生產具有抗腫瘤活性的重組海蚯蚓蛋白酶。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細胞增殖的活性，可作為新型的基因工程藥物。

海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆：

（1）設計引物：根據環節動物門蚯蚓和單環刺螠的蛋白酶較保守序列設計引物。

（2）目的基因cDNA?3′端序列擴增及測序：由步驟（1）得到引物，和來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，通過3′RACE（cDNA3′末端快速擴增技術）擴增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA?3′端序列。?PCR產物膠回收后分別連TA克隆載體，轉化細菌E.coli?DH5α，測序。

（3）目的基因cDNA?5′端序列擴增及測序：根據獲得的目的基因cDNA?3′端序列設計兩對特異性引物，以來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，采用5′RACE（cDNA?5′末端快速擴增技術），進行套式PCR，擴增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA?5′端序列。PCR產物膠回收后分別連TA克隆載體，轉化細菌E.coli?DH5α，測序。

（4）拼接：應用contigexpress軟件對步驟（2）和（3）得到的目的基因cDNA?3′端和5′端序列進行拼接，獲得本發明的海蚯蚓蛋白酶編碼基因的DNA（mRNA）序列。

（5）根據上述步驟（4）得到的DNA（mRNA）序列，使用DNAMAN軟件，獲得該海蚯蚓蛋白酶cDNA編碼的氨基酸序列。

一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列，該序列如下：