[發明專利]重組宿主細胞中的脫氧核糖核酸酶表達

在審

• 申請號: 201310520940.9
• 申請日: 2007-11-30
• 公開（公告）號: CN103540562A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 邁克爾.D.拉斯馬森;喬恩.M.珀森
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/90;C12N9/88;C12N9/14;C12N9/10;C12N9/02;C12N9/00;C12R1/08;C12R1/09;C12R1/10;C12R1/11;C12R1/125;C12R1/07
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 羅天樂

本申請是申請日為2007年11月30日，申請號為200780044260.7（國際申請號為PCT/EP2007/063109），名稱為“重組宿主細胞中的脫氧核糖核酸酶表達”的發明專利申請的分案申請。

序列表

本發明包含序列表。

技術領域

本發明涉及重組宿主細胞，其能夠產生各種重組多肽，特別是酶，基本不含污染DNA，以及產生基本不含污染DNA的所述多肽的方法。

背景技術

很多芽孢桿菌屬生產菌株都用于酶的重組生產，且常常有關于最終的酶產物中重組DNA存在的調節限制(regulatory?restriction)。

將來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)的核酸酶編碼基因整合入幾種聚(3-羥基烷酸(酯))(PHA)產生菌的基因組中并表達，以表達核酸酶并從而降低細胞裂解物(本來(otherwise))由于存在染色體DNA而導致的高粘度。葡萄球菌核酸酶易于在產生PHA的假單胞屬菌株中表達，并且定位于細胞周質，偶爾定位于培養基中，而不影響PHA產生或菌株穩定性[Zhuang等Reduction?of?Cell?Lysate?Viscosity?during?Processing?of?Poly(3-Hydroxyalkanoates)by?Chromosomal?Integration?of?the?Staphylococcal?Nuclease?Gene?in?Pseudomonas?putida.Appl?Environ?Microbiol.1999April;65(4):1524-1529]。

已經在轉錄和翻譯水平對地衣芽孢桿菌的磷酸鹽-饑餓(phosphate-starvation)刺激子進行了分析。顯示地衣芽孢桿菌發展了自己的策略來應對這種營養限制。通過分泌蛋白質組分析，將肌醇六磷酸酶鑒定為磷酸鹽-饑餓條件下豐度最高的(most?abundant)蛋白質。這項研究的數據表明，不同于枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌中的磷酸鹽饑餓不會誘導通常的SigmaB依賴性應激響應(Hoi等The?phosphate-starvation?response?of?Bacillus?licheniformis.2006.Proteomics,Vol.6(12)pp.3582-3601)。

在磷酸鹽饑餓的過程中，枯草芽孢桿菌調節PhoP調節子中的基因，以降低細胞對這種必需底物的需要，并促進從有機來源如磷壁酸和核酸回收無機磷酸鹽(phosphate)。PstS是在這些條件下高度誘導的蛋白質之一，其為高親和性ABC-類磷酸鹽轉移子中與磷酸鹽結合的脂蛋白組分。PstS由pst操縱子中的第一基因編碼，pst操縱子中其它四個成員編碼轉移子的整合蛋白和細胞質組分(Allenby等2004.Post-transcriptional?regulation?of?the?Bacillus?subtilis?pst?operon?encoding?a?phosphate-specific?ABC?transporter.Microbiol150(Pt8)pp.2619-2628)。

發明內容

本發明的目的是提供重組宿主細胞，所述細胞能夠產生各種產物，特別是酶，基本不含DNA，以及產生基本不含DNA的各種產物的方法，和構建所述重組宿主細胞的方法。

成功地改造得到重組芽孢桿菌屬宿主細胞，在發酵過程中，特別是在發酵末期，所述細胞表達重組核酸酶(脫氧核糖核酸酶)。

我們已經克隆并表達了來自枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的胞外脫氧核糖核酸酶，所述酶能夠非常有效地降解DNA。將編碼來自枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的這種胞外脫氧核糖核酸酶(核酸酶)的基因nucB克隆至pstS啟動子的下游。在發酵過程中，pstS啟動子受培養基中磷酸鹽水平的調節，調節方式為啟動子由低水平的磷酸鹽激活，由高水平的磷酸鹽阻斷。

起初，將熒光蛋白GFP用作由pstS啟動子表達的標記物，并且發現這種特殊的啟動子在發酵過程中受到非常嚴格的控制。因為當磷酸鹽水平較低的時候，大多數芽孢桿菌屬發酵都正在進入末期，所以由pstS啟動子表達nucB基因的過程會在發酵末期被激活，并在需要清除發酵液中多余的DNA時表達核酸酶。