[發明專利]一種甲胎蛋白的定量檢測方法

有效

• 申請號: 201310520866.0
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103558396A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 干寧;鄭磊;劉芹蘭;王前
• 申請（專利權）人: 寧波大學;南方醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所 44244
• 代理人: 胡濟元

技術領域

本發明涉及借助于測定材料的化學或物理性質來測試或分析材料，具體涉及蛋白質的檢測方法。

背景技術

人體甲胎蛋白（AFP）來源于胎兒的糖蛋白，分子量約為70KDa，成人的甲胎蛋白可由惡性腫瘤產生，特別是肝癌和胚胎細胞腫瘤，70-95%的原發性肝癌患者血清中AFP含量有明顯升高，在肝炎和肝硬化的患者中甲胎蛋白也常有輕微的升高。因此，對AFP的臨床分子診斷顯得十分重要，尤其是靈敏度檢測對及早發現腫瘤并制定治療方案極為重要。目前，測定AFP免疫檢測方法較多，最常用的血清檢測方法有：酶免疫法（EIA）、放射免疫法（RIA）、化學發光法以及時間分辨免疫熒光分析法（TRFIA）。其中，酶標法為半定量試劑，在準確性、靈敏度上存在很大的局限性，并且對于酶的活性極易受標記反應以及溫度、pH值及溶液中離子濃度等因素的影響、線性范圍窄、費時等缺點；放射性免疫法操作帶放射性以及標志物放置時間短，試劑有效期較短等缺點；化學發光法的優點是靈敏度高、線性范圍寬、分析時間短，但該方法尚存在下述不足：1、化學發光的產生通常是瞬間完成的，發光峰值很快衰減，而且成本較高；2、溫度和pH值對發光有很大影響，制約該方法的推廣使用。

因此，尋求一種方便快捷且靈敏度高的定量檢測甲胎蛋白的方法一直成為業界的努力方向。

發明內容

本發明所要解決的問題是提供一種甲胎蛋白的定量檢測方法，該方法不僅靈敏度高，而且方便快捷、成本低。

本發明解決上述問題的技術方案如下：

一種甲胎蛋白的定量檢測方法，該方法由以下步驟組成：

（1）分別按下述方法制備酶標抗體和負載抗體的納米金磁微粒：

（1.1）制備酶標抗體：取8μL糖化酶溶于0.2mL體積濃度為1.25%的戊二醛，室溫結合3h后用除鹽柱去除游離的戊二醛，得醛化糖化酶溶液；先將0.1mg甲胎蛋白抗體溶于13μL0.15mol/L?NaCl，再與所得到的醛化糖化酶溶液混合后，加入1mol/L?pH9.6的碳酸鹽緩沖液，調節pH至9.0-9.5，4℃下結合12h后加入4μL0.2mol/L賴氨酸，終止反應后4℃放置2h；

（1.2）制備負載抗體的納米金磁微粒：取粒徑為50nm的納米金磁微粒5mg，用去離子水洗三遍，加入NaOH調pH至9.0，然后依次加入0.2mg甲胎蛋白抗體和30mg牛血清白蛋白，4℃下反應6h，外加磁性條件下磁性分離，洗滌，得到負載抗體的納米金磁微粒；

（2）分別按下述方法進行定量線性方程的建立和甲胎蛋白抗原樣品的檢測：

（2.1）定量線性方程的建立：取甲胎蛋白抗原標準品，先按相同體積配制一系列不同濃度的抗原標準品溶液，再分別將每一抗原標準品溶液50μL加入到步驟（1.2)所得負載抗體的納米金磁微粒的免疫反應界面中，先37℃溫育30min，洗滌；將步驟(1.1)制備的酶標抗體配成80μg/ml懸液，在金磁納米免疫反應界面中滴加50μL酶標抗體懸液，37℃溫育30min，去離子水洗滌；然后，往所述免疫反應界面加入濃度為20mg/mL的液化淀粉溶液10μL，60℃下反應30min后用血糖儀測得葡萄糖的濃度；最后，采用平均斜率法以葡萄糖濃度對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸便得到葡萄糖濃度與甲胎蛋白濃度對應關系的線性方程；其中，所述的液化淀粉溶液是先將淀粉用PBS調成20mg/mL的淀粉溶液并煮沸，然后按淀粉溶液︰耐高溫α-淀粉酶=500︰3的體積比加入耐高溫α-淀粉酶得到；

（2.2）甲胎蛋白抗原樣品的檢測：將甲胎蛋白抗原樣品加入到金磁納米免疫反應界面中，采用與步驟（2.1）中所述檢測甲胎蛋白抗原標準品中葡萄糖濃度的同樣方法和反應條件，用血糖儀測得甲胎蛋白抗原樣品中的葡萄糖濃度；然后，將甲胎蛋白抗原樣品的葡萄糖濃度值代入步驟（2.1）所得到的線性方程中即可算出甲胎蛋白抗原樣品的甲胎蛋白濃度。

上述方案中，所述的納米金磁微粒為購于西安金磁納米生物技術有限公司的液態產品，該產品中納米金磁微粒的濃度為5mg/mL。

上述方案中，所述的血糖儀是市面上常見的便攜式血糖儀，使用便攜式血糖儀檢測快、儀器試劑成本低。

本發明所述的方法利用糖化酶標記的抗體作為二抗探針，利用糖化酶水解淀粉產生葡萄糖這一過程，實現將甲胎蛋白的檢測轉化為葡萄糖的檢測，夾心免疫反應在金磁納米顆粒界面進行。