[發明專利]納米肝素鈉-PEI-Ca2+基因導入材料及制備方法

有效

• 申請號: 201310520829.X
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103820493B
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 王深明;張德元;劉勇;夏浩明;周鴻雁;李梓倫;常光其;徐安武
• 申請（專利權）人: 王深明;徐安武;張德元
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C08L5/10;C08L79/08;C08K3/16
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 成明新

本發明公開了一種納米肝素鈉?PEI?Ca²⁺基因導入材料及制備方法，它為肝素鈉、聚醚酰亞胺（PEI）、氯化鈣組合成平均直徑為100nm左右的肝素鈉?PEI?Ca²⁺納米球形材料，肝素鈉含量為0.54g/g，聚醚酰亞胺（PEI）含量為0.16g/g，鈣離子含量為0.30g/g。本發明還公開了納米肝素鈉?PEI?Ca²⁺基因導入材料的制備方法。本發明具有較高的轉染效率，在人乳腺癌細胞中可以達到40%左右；毒性低，因為肝素鈉、氯化鈣具有良好的生物相容性，細胞生存率很高；材料分散性良好，符合對轉染的要求；非常低的成本，材料制備反應簡單易操作，可重復性好。

[技術領域]

本發明涉及一種高轉染效率、低細胞毒性的功能化納米肝素鈉 -PEI-Ca²⁺基因導入材料及制備方法。

[背景技術]

隨著人類基因圖譜測定的完成，我們對人類疾病發病機制的認識在基因水平上取得了突破性的進展。目前研究表明，有許多疾病的發生及發展與基因密切相關。如果可以篩查出與疾病特異相關的基因片段或者基因突變，就可以有針對性地在基因水平上進行特異治療，如通過導入相關缺失基因或沉默基因，以增強相關缺失功能或者沉默致病基因，從而達到徹底治療的目的。將目的基因安全有效地導入生物體內是目前此研究領域中的關鍵和難點。

基因導入系統或方法可以分為兩類：病毒型基因導入系統，以逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒為載體；非病毒型基因導入，如顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀、陽離子脂質體法、以及新興的納米基因導入材料。由于病毒型基因導入系統存在許多嚴重的不足，如病毒轉染有可能激活原癌基因等，故非病毒型轉染方式是目前的研究熱點，在上述非病毒式轉染中，顯微注射一次只能處理一個細胞；基因槍穿透力十分有限；磷酸鈣共沉淀法結果不穩定；僅陽離子脂質體法表現了良好的轉染效率，但是過高的毒性又限制了它的應用。

[發明內容]

本發明的目的在于提供一種功能化納米肝素鈉-PEI-Ca²⁺基因導入材料及制備方法，其基因導入材料的生物相容性好，且由低毒的材料組成的復合材料，它是屬于非病毒型載體，表現出良好的細胞相容性，穩定且較高的轉染效率。

為了實現上述目的，本發明的納米肝素鈉-PEI-Ca²⁺基因導入材料技術方案為：一種納米肝素鈉-PEI-Ca²⁺基因導入材料，它為肝素鈉、聚醚酰亞胺（PEI）、氯化鈣組合成平均直徑為100nm左右的肝素鈉-PEI-Ca²⁺納米球形材料，肝素鈉含量為0.54g/g，聚醚酰亞胺（PEI）含量為0.16g/g，鈣離子含量為0.30g/g。

所述納米肝素鈉-PEI-Ca²⁺基因導入材料能和綠色熒光蛋白質?；騪GFP以非共價方式結合，形成無機納米基因導入系統，用于基因轉染。

制備功能化納米肝素鈉-PEI-Ca²⁺基因導入材料的方法包括如下步驟：（1）取材料：氯化鈣、聚醚酰亞胺（PEI）、肝素鈉，分析純；使用時無進一步純化步驟，所有的制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲 5分鐘，然后雙蒸水清洗，并用洗液H₂0/HNO₃（65%）/H₂O₂（35%）（1：1：1，v/v/v）清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在空氣中晾干。（2）材料的制備：用去離子水溶解氯化鈣制備0.1M新制的氯化鈣溶液；用去離子水稀釋肝素鈉溶液制備2g/L新制的肝素鈉溶液；制備4g/L新制的PEI溶液；首先，在10ml去離子水中加入 4mL2g/L新制的肝素鈉溶液、+1mL4g/L新制的PEI溶液，+2mL0. 1M新制的氯化鈣溶液，置于25mL的燒杯中，充分攪拌3天后，靜置 1天，在8000r/m速度離心，之后用雙蒸水洗至PH=7，最終樣品在室溫下晾干。