[發(fā)明專(zhuān)利]利用玉米雜交種種質(zhì)的逆向分子育種方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310520240.X
• 申請(qǐng)日: 2013-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103548670A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李平;程侖
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南通新禾生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A01H1/02
• 分類(lèi)號(hào): A01H1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 北京法思騰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子育種領(lǐng)域，具體地涉及利用玉米雜交種種質(zhì)的逆向分子育種方法。

背景技術(shù)

玉米是世界和我國(guó)播種面積第一的作物。隨著玉米需求的進(jìn)一步增加，耕地在減少，玉米供需關(guān)系很可能進(jìn)一步趨緊。

近幾十年來(lái)，農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)的玉米育種發(fā)展極快。種質(zhì)資源是種業(yè)公司的核心資源，但經(jīng)常被壟斷。歐美玉米雜交種由于具有高產(chǎn)、耐密、品質(zhì)好、適合機(jī)收等特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)種業(yè)企業(yè)普遍采用引進(jìn)專(zhuān)利過(guò)期歐美自交系或歐美雜交種二環(huán)系選育的方式進(jìn)行種質(zhì)資源補(bǔ)充和品種培育。過(guò)往這種選育過(guò)程主要依靠育種家經(jīng)驗(yàn)和組配雜交種產(chǎn)量測(cè)定（圖1），因此周期較長(zhǎng)（6～7年），且雜優(yōu)模式不固定，有利基因利用率低。時(shí)間（品種研發(fā)周期）決定了商業(yè)育種的成敗。目前跨國(guó)公司品種單產(chǎn)增幅每年約1.2%，平均6-7年即可開(kāi)發(fā)形成新一代品種。單純采用常規(guī)育種手段利用歐美雜交種和專(zhuān)利過(guò)期自交系，由于育種周期較長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)質(zhì)縮小與跨國(guó)公司的水平差距，更無(wú)法形成研發(fā)推動(dòng)銷(xiāo)售，銷(xiāo)售反哺研發(fā)的產(chǎn)業(yè)良性循環(huán)發(fā)展模式。

近年來(lái)，大量的玉米SNP分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)的高通量玉米指紋芯片已被商業(yè)化。

反向育種概念由Dirks等提出（Dirks?R等人(2006),Reverse?Breeding.United?States?Patent20060179498;Dirks?R等人(2009),Plant?Biotechnology?Journal,2009,7:837-845）。基本思路是通過(guò)使染色體重組酶失去活性，進(jìn)而在雜交種的分離后代中的染色體重組現(xiàn)象消失，再使用數(shù)量較少的分子標(biāo)記（每條染色體一個(gè)分子標(biāo)記），結(jié)合雙單倍體技術(shù)，即可在后代中分別選擇出與雜交種父本、母本完全一樣的可育自交系，由此父本、母本又可以配出原先的雜交種，實(shí)現(xiàn)了原雜交種的無(wú)限復(fù)制。這項(xiàng)技術(shù)的核心在于抑制染色體重組酶，可使用基因敲除或直接使用染色體重組酶活性缺失的植株實(shí)現(xiàn)。但這項(xiàng)技術(shù)無(wú)法直接在跨國(guó)公司的商業(yè)玉米雜交種上使用，因?yàn)樯虡I(yè)玉米雜交種中染色體重組酶活性正常，除非將雜交種進(jìn)一步做基因敲除等有相當(dāng)難度的復(fù)雜處理。

近反向育種概念由van?Dun等提出（van?Dun等人(2008),Near?Reverse?Breeding.United?States?Patent20080098496Al.）?；舅悸肥峭ㄟ^(guò)獲得部分分離重組2倍體的孢子，再結(jié)合雙單倍體技術(shù)，在后代中分別選擇出互補(bǔ)的可育自交系。由此互補(bǔ)自交系又可以配出原先的雜交種，實(shí)現(xiàn)了原雜交種的無(wú)限復(fù)制。這項(xiàng)技術(shù)的核心在于促使植物產(chǎn)生2倍體孢子，且成功識(shí)別、分離此類(lèi)孢子。仍然或需要使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，或需要流式細(xì)胞儀、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)等復(fù)雜設(shè)備與技術(shù)，且僅能選出互補(bǔ)而非與雜交種父母本相似的互補(bǔ)自交系，若應(yīng)用于商業(yè)玉米雜交種，則可能改變雜優(yōu)模式，產(chǎn)生的自交系無(wú)法在雜優(yōu)群內(nèi)循環(huán)利用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供利用玉米雜交種種質(zhì)的逆向分子育種方法。

根據(jù)本發(fā)明的利用玉米雜交種種質(zhì)的逆向分子育種方法包括以下步驟：

（1）根據(jù)玉米全基因組重測(cè)序結(jié)果，提取雜交種種胚，及雜交種種皮的DNA，之后進(jìn)行DNA的雜交及芯片掃描，檢測(cè)出雜交種種胚及種皮的高密度基因，由此從種胚及種皮的高密度基因型導(dǎo)出雜交種父本及母本的高密度基因型；

（2）溫室種植該玉米雜交種F1代，套袋自交產(chǎn)生F2種粒；

（3）提取玉米F2群體的葉片DNA；

（4）以玉米192個(gè)SNP位點(diǎn)的低密度基因芯片測(cè)定F2群體的SNP的基因型：