[發明專利]一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310520015.6
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103525788A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 姚斌;孟昆;涂濤;羅會穎;石鵬君;黃火清;王亞茹;柏映國;楊培龍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;A23L2/04;A23L2/84;C12R1/80
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體地，本發明涉及一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術

果膠是一類帶負電荷的高分子多糖,由不同酯化度的D-(+)--半乳糖醛酸以ɑ-1,4糖苷鍵連接而成的多糖鏈,常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等組成的側鏈,分子量介于25～360kDa之間(Jayani?et?al.,2005)。它廣泛存在于高等植物，特別是水果和蔬菜的組織中，是果蔬植物細胞中膠層（胞間層）的主要成分。

內切多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）屬于糖苷水解酶第28家族（GH28），作用于果膠酸時能隨機地從多聚半乳糖醛酸鏈內部消解α-1,4-糖苷鍵，產生聚合度為10～14的寡聚半乳糖醛酸。它是一種降解果膠的重要工業用酶，主要應用在食品工業中的果蔬汁生產加工領域。果蔬汁的混濁和粘度大等問題主要是由果膠質引起的，在果蔬汁的提取和澄清過程通過酸性果膠酶處理可提高果蔬汁的出汁率和澄清度(Nakkeeran?et?al.,2011;Rehman?et?al.,2013)。

我國果蔬汁生產規模逐年擴大，目前在商品化的果膠酶主要有黑曲霉等真菌來源的復合果膠酶酶系，也有單一的果膠水解酶、果膠裂解酶和果膠酯酶酶種。從質量上看，現有果膠酶還普遍存在酶活力不高，穩定性較差的問題。高比活、高催化效率的多聚半乳糖醛酸酶工程菌株的獲得主要通過誘變、篩選和酶分子改良獲得。誘變分為自然突變和人工誘變，自然突變成功的幾率非常小，人工誘變的工作量較大且有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質難以控制。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。酶分子改良目的性強，針對酶分子具體結構分析進行改造，從而達到提高比活力和催化效率的目的。

發明內容

本發明的目的是提供了一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體。

本發明的再一目的是提供編碼上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的基因。

本發明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發明以來源于Penicillium?sp.的酸性多聚半乳糖醛酸酶為母本，采用分子生物學技術對酸性多聚半乳糖醛酸酶序列進行區域替換后表達。

根據本發明的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體，是多聚半乳糖醛酸酶的催化活性通道loop區域替換后得到的突變體，即多聚半乳糖醛酸酶的loop區域氨基酸序列由“RNGDKGSL”突變為“SAGDSQG”

所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

SPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVPAGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGTNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLAHNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNSAGDSQGGHNTDGFDIGDSDHITITGATVYNQDDCLAINSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITSQGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPANTC

所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。