[發(fā)明專利]基于Ion ProtonTM測(cè)序平臺(tái)的小片段DNA文庫(kù)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310518435.0
• 申請(qǐng)日: 2013-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103572378A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 糜慶豐;羅東紅;陳治;李君寶;饒興薔;陳樣宜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州愛(ài)健生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C40B40/06;C12Q1/68
• 代理公司: 北京萬(wàn)慧達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11111
• 代理人: 楊穎;張金芝

1.一種基于Ion?Proton^TM測(cè)序平臺(tái)的小片段DNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

（1）樣品DNA提取；

（2）末端修復(fù)：將樣品DNA與試劑I混合，室溫下孵育進(jìn)行反應(yīng)；

（3）片段篩選：對(duì)步驟（2）所得的混勻DNA液進(jìn)行片段篩選及純化，得到片段集中的平末端DNA片段；

（4）接頭連接：將步驟（3）所得到的DNA片段與試劑II、接頭、特異標(biāo)簽序列反應(yīng)后純化，得到加了接頭的DNA片段；

（5）PCR擴(kuò)增：將步驟（4）所得到的DNA片段加入試劑III，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化，得到小片段DNA文庫(kù)；

（6）文庫(kù)檢測(cè)：將步驟（5）所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物采用Q-PCR和Agilent?Bioanalyzer2100檢測(cè)文庫(kù)濃度及文庫(kù)片段大小；

（7）高通量測(cè)序：對(duì)步驟（6）所得到的合格文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，優(yōu)選采用Ion?Proton^TM測(cè)序平臺(tái)；

其中，步驟（2）中的試劑I的pH值為7.4～7.6，溶劑為水，溶質(zhì)為：5mM～20mM緩沖鹽溶液、50mM～200mM可溶性鹽溶液、1mM～5mM二硫蘇糖醇、8mM～12mM?ATP、10mM?dNTPs混合液和End?Repair酶；其中緩沖鹽溶液為Tris-HCl、磷酸鹽溶液等緩沖鹽溶液，優(yōu)選為Tris-HCl；可溶性鹽溶液為NaCl、KCl等鹽溶液，優(yōu)選為KCl；試劑I優(yōu)選pH值為7.5，溶劑為水，溶質(zhì)為：10mM?Tris-HCl，100mM?KCl、2mM二硫蘇糖醇、10mM?ATP、10mM?dNTPs混合液、6U/μl?End?Repair酶；

所述步驟（4）中的混合試劑II的pH值為7.5～7.8，溶劑為水，溶質(zhì)為：20mM～80mM緩沖鹽溶液、5mM～20mM?MgCl₂、5mM～50mM二硫蘇糖醇、0.5mM～2mM?ATP、2mM?dNTPs混合液、DNA連接酶和Nick?Repair酶；其中緩沖鹽溶液為Tris-HCl、磷酸鹽溶液等緩沖鹽溶液，優(yōu)選為Tris-HCl；試劑II優(yōu)選pH值為7.6，溶劑為水，溶質(zhì)為：50mM?Tris-HCl、10mM?MgCl₂、10mM二硫蘇糖醇、1mM?ATP、2mM?dNTPs混合液、400U/μl?DNA連接酶和10U/μlNick?Repair酶；

所述步驟（5）中混合試劑III的pH值為7.6～7.9，溶劑為水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)：50mM～100mM緩沖鹽溶液、18mM～30mM可溶性鹽溶液、2mM～5mM?MgSO₄、200μM～300μM?dNTPs混合液、DNA聚合酶和10mM引物混合液；其中緩沖鹽溶液為Tris-SO₄、Tris-HCl等緩沖鹽溶液，優(yōu)選為Tris-SO₄；可溶性鹽溶液為硫酸鹽溶液，優(yōu)選為(NH₄)₂SO₄；試劑III優(yōu)選pH值為7.6，溶劑為水，溶質(zhì)為：66mM?Tris-SO₄(pH8.9)、19.8mM(NH₄)₂SO₄、2.4mM?MgSO₄、220μM?dNTPs混合液、22U/ml重組Taq?DNA?polymerase及Pyrococcus?species?GB-Dthermostable?polymerase和10mM引物混合液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（1）中的樣品DNA提取自孕婦外周血的血漿。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（1）采用試劑盒提取DNA，DNA提取試劑盒可使用TIANGEN公司的TIANamp?Micro?DNA?kit（產(chǎn)品號(hào)為DP316），也可使用Qiagen公司的QIAamp?MinElute?Virus?Spin?Kit（產(chǎn)品號(hào)為57704）。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（3）通過(guò)Ampure磁珠進(jìn)行片段篩選，篩選的片段大小范圍是100-350bp。