[發(fā)明專(zhuān)利]雙基因缺失的副豬嗜血桿菌及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310518321.6
• 申請(qǐng)日: 2013-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103865834A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈愛(ài)卿;王貴平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12N15/74;A61K39/102;A61P31/04;C12R1/21
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌及其構(gòu)建方法。?

背景技術(shù)

副豬嗜血桿菌病是近年來(lái)嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的新發(fā)細(xì)菌性傳染病，引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜腦炎等，發(fā)病率一般為10-15%，死亡率可達(dá)50%以上，引起了人們的日益重視。該病的致病菌副豬嗜血桿菌（Hps）的血清型復(fù)雜多樣，按Kieleetin.Rapp-Gbarideosn(KRG)瓊脂擴(kuò)散血清分型方法，至少可將Hps分為15個(gè)血清型，另有20%以上的分離株血清型不可定。己有的資料表明，Hps具有明顯的地方性特征，基于某個(gè)或某些特定血清型菌株的全菌體制備的滅活疫苗在不同血清型之間所產(chǎn)生的交叉保護(hù)率很低，急待研制具有高效交叉保護(hù)力的疫苗。因此弱毒活疫苗的研制是當(dāng)前多數(shù)傳染病的研究熱點(diǎn)。?

目前關(guān)于Hps的致病機(jī)理尚不清楚，aroA基因和omp2基因被認(rèn)為是Hps的潛在毒力基因，在其它細(xì)菌中有較深的研究報(bào)道。aroA基因是細(xì)菌芳香族氨基酸代謝通路中一個(gè)非常重要的酶，該酶活性的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力降低等生物學(xué)變化，已被應(yīng)用于多種細(xì)菌的缺失弱毒疫苗的構(gòu)建。omp2在流感嗜血桿菌定殖中發(fā)揮重要作用，且已被證實(shí)與人的粘蛋白的特定成分結(jié)合，是細(xì)菌侵入機(jī)體過(guò)程中一個(gè)重要的因子。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要是利用現(xiàn)代基因工程原理和分子生物學(xué)手段對(duì)Hps潛在的毒力因子aroA基因和omp2基因進(jìn)行缺失，構(gòu)建Hps不含抗性標(biāo)記的雙基因缺失菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性及致病力等進(jìn)行探討，為進(jìn)一步研制新型高效可提供高交叉保護(hù)效力的基因工程活疫苗打下基礎(chǔ)。?

本發(fā)明的目的在于提供一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌，構(gòu)建一種副豬嗜血桿菌的變異株，用于制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病滅活疫苗。?

本發(fā)明的另一目的在于雙基因缺失的副豬嗜血桿菌的構(gòu)建方法。?

本發(fā)明的又一目的在于雙基因缺失的副豬嗜血桿菌在制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病滅活疫苗中的應(yīng)用。?

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：?

一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌，其是菌株的aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的雙基因缺失株，菌株保藏號(hào)為：CCTCC?NO:M2013460。該菌株于2013年9月29日由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心接受保藏，并于2013年10月9日檢測(cè)存活，該菌株保藏名稱(chēng)為副豬嗜血桿菌GD-1;保藏中心地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編為430072。?

一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌的構(gòu)建方法，其步驟如下：?

A）基因的克隆與重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建：參照GenBank中aroA、omp2基因的序列，從H10中擴(kuò)增了aroA和omp2基因的上下游片段。將得到的上下游片段，連接到攜帶蔗糖敏感基因(SacB)的自殺性質(zhì)粒pEMOC2上，構(gòu)建缺失了第394131-394631位核苷酸的aroA基因的重組自殺性質(zhì)粒pEMΔaroA和第181258-181643位核苷酸的omp2基因的重組自殺性質(zhì)粒pEMΔomP2；?

B）接合轉(zhuǎn)移與副豬嗜血桿菌單基因缺失株的構(gòu)建：以轉(zhuǎn)化了上述重組自殺性質(zhì)粒pEMΔaroA的大腸桿菌β2155為供體菌，血清5型菌株H10為受體菌進(jìn)?行接合轉(zhuǎn)移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的平皿上，篩選Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，進(jìn)行第一次PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中，鑒定正確的接合子在不含NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促使第二次同源重組的發(fā)生，涂布含10%蔗糖的平皿，并轉(zhuǎn)印到Cm平皿上，篩選出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并進(jìn)行第二次PCR鑒定，確定發(fā)重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)丟失，從而構(gòu)建出aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸的單基因缺失株HS02；?