[發(fā)明專利]一種龜甲膠及其制品的檢測(cè)物及其質(zhì)譜檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310516678.0
• 申請(qǐng)日: 2013-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103630619A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尤金花;嵇傳良;秦玉峰;周祥山;田守生;郭尚偉;段小波;張?jiān)葡?/a>
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東東阿阿膠股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 北京和信華成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11390
• 代理人: 胡劍輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種驢、馬、牛、羊或鹿源性成分的檢測(cè)物及其檢測(cè)方法，具體可應(yīng)用于龜甲膠及其制品的真?zhèn)舞b定，屬于中藥檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

龜甲，即龜科動(dòng)物烏龜(Chinemys?reevesii)的背甲及腹甲，屬于傳統(tǒng)名貴中藥。據(jù)最新版的中國(guó)藥典記載，服用龜甲能夠滋陰潛陽(yáng)，益腎強(qiáng)骨，養(yǎng)血補(bǔ)心。近些年來(lái)，隨著生物學(xué)水平的提高，龜甲的相關(guān)研究也不斷深入。有研究表明，龜甲粉末及其提取物不僅能夠增強(qiáng)肝功能、緩解壓力，還具有抗癌以及調(diào)節(jié)免疫抵抗力的功效。以龜甲為原料而制成的兩類產(chǎn)品龜苓膏和龜甲膠在整個(gè)中藥市場(chǎng)上占據(jù)著重要的位置。

據(jù)2010年版中國(guó)藥典記載，龜甲膠是以龜甲為原料，經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠，性咸、甘、涼，歸肝、腎、心經(jīng)。能夠滋陰、養(yǎng)血、止血，主要用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等。長(zhǎng)期服用龜甲膠還有利于增強(qiáng)機(jī)體自身調(diào)節(jié)，能夠延年益壽，也利于陰虛陽(yáng)亢患者的身體康復(fù)。隨著生活水平的不斷提高，與阿膠類似，龜甲膠也成為人們進(jìn)補(bǔ)的首選之一。

由于龜甲自身比較名貴，藥用價(jià)值顯著，并且龜肉也常常用于烹飪各類補(bǔ)品供人們食用，近些年來(lái)對(duì)各種龜類的捕殺現(xiàn)象十分嚴(yán)重，甚至于某些龜類品種瀕臨滅絕。因此，龜甲原料的供應(yīng)非常有限，并且價(jià)格高昂，也直接影響到了龜甲膠的生產(chǎn)。在龜甲膠市場(chǎng)上存在某些假冒偽劣產(chǎn)品，其制作原料并非龜甲，而是由其他動(dòng)物雜皮、碎骨代替，包括牛皮，甚至病死動(dòng)物之皮，臟皮、爛皮等。該類假冒偽劣產(chǎn)品一旦成形，無(wú)論外觀、色澤、氣味都與正品龜甲膠及其相似，真?zhèn)坞y辨。服用這些偽品不僅沒(méi)有任何療效，還很可能對(duì)身體有害，后果十分嚴(yán)重。

膠類中藥由動(dòng)物的皮、骨、甲等熬制而成膠類物質(zhì)，包括阿膠、龜甲膠、鹿角膠等，具有典型民族特色的傳統(tǒng)中藥。膠類中藥一般經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間高溫蒸煮濃縮而成，主要成分非常相近且不同廠家的生產(chǎn)工藝存在差異，采用紅外、近紅外、X-衍射等方法對(duì)膠類中藥純品進(jìn)行真?zhèn)舞b別常存在判斷不準(zhǔn)確等情況。膠類中藥中龜源性成分的鑒別，已有學(xué)者從DNA角度進(jìn)行鑒別，但只是定性，存有假陰性與假陽(yáng)性現(xiàn)象，且操作較為復(fù)雜。有報(bào)道稱從多肽的角度利用質(zhì)譜檢測(cè)膠類中藥中龜源性成分，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。但目前還沒(méi)有從膠原多肽的角度，一次性鑒別龜甲膠及其制品中偽品成分的檢測(cè)方法。

膠類中藥中主要成分為膠原蛋白多肽，不同動(dòng)物的膠原蛋白氨基酸序列存在差異，除烏龜之外的不同物種中，含有的穩(wěn)定存在的同一多肽可作為龜甲膠中偽品成分的特征性多肽，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切，利用質(zhì)譜完全可以對(duì)龜甲膠進(jìn)行溯源鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種龜甲膠及其制品的檢測(cè)物及其真?zhèn)舞b定方法，該方法操作簡(jiǎn)單，特征性強(qiáng)，靈敏度高，可用于龜甲膠及其制品中偽品成分的溯源鑒定。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

首先，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)龜甲膠及其制品的方法，其利用龜甲膠制品與其他仿制品基因組中具有特異性核苷酸序列或氨基酸序列的不同進(jìn)行檢測(cè)，所述特異性氨基酸序列如SEQ.ID?No1所示。

優(yōu)選的，所述龜甲膠制品選自龜甲膠制成的食品、保健品或藥品中的一種，且配方中不含有驢、馬、牛、羊、鹿源性成分。

優(yōu)選的，所述其他仿制品是指驢、馬、牛、羊或鹿中的一種或幾種熬制而成的膠類物質(zhì)。

更具體地，所屬包括如下步驟：

（1）選取龜甲膠制品與其他仿制品基因組中特異性氨基酸序列或氨基酸序列,所述特異性氨基酸序列如SEQ.ID?No1所示;

（2）將龜甲膠或其制品溶解，或提取所述龜甲膠或其制品的蛋白多肽類成分并溶解，隨后加入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；

（3）將步驟（2）得到的酶切后的溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀，以龜甲膠純品為基質(zhì)，加入步驟（1）所述氨基酸序列作為對(duì)照，并選擇該氨基酸序列的母離子m/z406.2及其子離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

如果檢出該離子的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且其子離子與對(duì)照品的子離子一致，則所述龜甲膠或其制品中含有該偽品成分；如果沒(méi)有與對(duì)照品保留時(shí)間一致的該離子，則不含有該偽品成分。

優(yōu)選的，步驟（2）中所述溶解所用的試劑是質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%、pH值8.0的NH₄HCO₃溶液；所述限制性內(nèi)切酶為胰蛋白酶。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)龜甲膠及其制品的分子標(biāo)記物，該分子標(biāo)記物的氨基酸序列如SEQ.ID?No1所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了編碼所述的蛋白的基因。