[發(fā)明專利]一種溶菌酶聯(lián)合超聲波清洗儀破碎法測(cè)定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌胞內(nèi)鉻價(jià)態(tài)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310515897.7
• 申請(qǐng)日: 2013-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103555816A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張娥;陳曉明;羅學(xué)剛;王丹;唐運(yùn)來(lái)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/34
• 分類號(hào): C12Q1/34;C12Q1/02;C12R1/44;C12R1/46;C12R1/01;C12R1/07;C12R1/16;C12R1/145;C12R1/085
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 卿誠(chéng);房云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種溶菌酶聯(lián)合超聲波清洗儀測(cè)定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌胞內(nèi)的鉻價(jià)態(tài)的方法，屬于微生物領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

鉻（Chromium）是生物體所必需的微量元素之一，于1797年首次被法國(guó)化學(xué)家Lvauquelin發(fā)現(xiàn)，是一種用途廣泛而又對(duì)人體危害較大的重金屬元素之一。自然環(huán)境中主要存在的兩種價(jià)態(tài)Cr³⁺和Cr⁶⁺，他們有著幾乎相反的性質(zhì)：適量的Cr³⁺可以降低人體血漿中的血糖濃度，提高人體胰島素的活性，促進(jìn)糖和脂肪的代謝，提高人體的應(yīng)激反應(yīng)能力等；而Cr⁶⁺則是一種強(qiáng)氧化劑，具有強(qiáng)致癌變、致畸變、致突變作用，對(duì)生物體傷害較大。研究發(fā)現(xiàn)很多微生物都能對(duì)六價(jià)鉻進(jìn)行胞內(nèi)還原，以達(dá)到鉻污染環(huán)境的修復(fù)目的，這種微生物活體修復(fù)技術(shù)以其投資小、運(yùn)行費(fèi)用低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)引起了廣泛關(guān)注。因此找到一種簡(jiǎn)便又快捷的測(cè)定微生物胞內(nèi)鉻價(jià)態(tài)的方法,具有重要意義。?

目前，常見(jiàn)的微生物胞內(nèi)產(chǎn)物釋放是通過(guò)細(xì)胞破碎的方法達(dá)到的，主要分為兩大類：一為機(jī)械法，包括超聲波破碎法、珠磨法、壓榨法、高壓勻漿法等；二為非機(jī)械法，包括酶溶法、化學(xué)裂解法等。近年來(lái)，一些研究人員還發(fā)現(xiàn)用激光破碎細(xì)胞、高速相向流撞擊法、冷凍-噴射法和低電壓細(xì)胞破碎等方法來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，收到了很好的成效。在實(shí)際生產(chǎn)中，必須根據(jù)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的化學(xué)組成成分和結(jié)構(gòu)選擇合適的方法破碎細(xì)胞，才能最大程度的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，減小破碎方式對(duì)胞內(nèi)金屬離子的價(jià)態(tài)影響。?

超聲波細(xì)胞破碎法是實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)胞破碎法，是一種液相剪切破碎法。經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在20kHz左右的超聲波作用于細(xì)胞懸浮液一定時(shí)間，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁會(huì)受到破壞，但是增加超聲波的頻率卻對(duì)細(xì)胞的破碎程度沒(méi)有明顯的影響，說(shuō)明超聲波的細(xì)胞破碎效率與超聲波的聲頻、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度以及細(xì)胞種類有關(guān)。這種細(xì)胞破碎方法主要面臨的問(wèn)題是超聲波在細(xì)胞破碎處理過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生熱量而使溫度不斷升高，因此在生產(chǎn)使用中還需要加大投入來(lái)控制操作溫度，而不至于影響胞內(nèi)金屬價(jià)態(tài)的改變；同時(shí)該破碎方法一次只能處理一個(gè)樣品，操作耗時(shí)；另外還需要控制好待破碎細(xì)胞的濃度，這樣才能保證聲波更好的傳遞，才能更好的讓細(xì)胞得到破碎。?

溶酶法是現(xiàn)在普遍應(yīng)用的一類細(xì)胞破碎方法之一，利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)?胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，由N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸借β-1,4糖苷鍵連接為聚糖骨架，再與四肽側(cè)鏈及五肽交聯(lián)橋共同構(gòu)成。溶菌酶則可通過(guò)破壞細(xì)菌特別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵破碎細(xì)胞，但存在破碎不夠徹底的缺點(diǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠最大程度的破碎細(xì)胞，最小程度的影響胞內(nèi)重金屬的價(jià)態(tài)測(cè)定的方法。?

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：?

一種溶菌酶聯(lián)合超聲波清洗儀測(cè)定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌胞內(nèi)的鉻價(jià)態(tài)的方法，包括如下步驟：?

1）將革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌在含鉻的NA（Nutrient?Agar）培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，取出離心，取上清測(cè)定六價(jià)鉻和總鉻的濃度，作為細(xì)胞外的鉻濃度；不加菌的作為對(duì)照組，測(cè)得的總鉻濃度即為初始總鉻濃度；?

2）取菌液沉淀先后經(jīng)過(guò)溶菌酶處理和超聲波清洗儀處理，離心后取上清液，分別測(cè)定其中的六價(jià)鉻和總鉻的濃度，作為細(xì)胞內(nèi)的鉻濃度。?

在本發(fā)明中，所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是指將細(xì)菌作革蘭氏染色，染后菌體呈紫色的細(xì)菌。包括但不限于葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、肺炎雙球菌(Pneumococcus)、炭疽桿菌(Bacillus?anthraci)、白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium?diphtheriae)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridium?tetani)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus?cereus)等。?

在本發(fā)明中，所述NA培養(yǎng)基為蛋白胨、牛肉膏、NaCl、純凈水、瓊脂配制而成，其pH=7.0。在一個(gè)具體的實(shí)例中，所述NA培養(yǎng)基為蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl5g、純凈水1000mL、瓊脂25g。?