[發明專利]一種天然材料復合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201310513221.4
• 申請日: 2013-10-28
• 公開（公告）號: CN103525803A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 田亞平;查小紅;楊廣明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/04;C12H1/15;C12R1/01
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種天然材料復合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法，其特征在于將從普羅威登斯菌（Providencia?sp.）JNB815菌體細胞破碎液中提取的游離雙功能酶，經殼聚糖吸附、明膠包埋和京尼平交聯，得固定化酒用雙功能酶；工藝為：

A．游離酶提取：

（1）菌種：采用普羅威登斯菌（Providencia?sp.）JNB815，本實驗室篩選，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC?No.8326；

（2）游離酶的提取：菌種經過種子培養和發酵培養獲得一定量菌體，將發酵液4℃、8000rpm離心5?min后，棄上清，所得菌體用去離子水洗滌兩次，pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，離心獲得全細胞；將獲得的全細胞用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進行超聲波破碎，超聲波破碎條件為300?W、15min，破碎時間3?s、間隔時間3?s，處理量35?mL；破碎液在4℃、10000?rpm離心20?min，收集上清液，即為游離酶酶液；

B．固定化過程：

（3）稱取殼聚糖3~5?g、明膠1~3?g，溶于100?mL?1%的乙酸中，置于磁力攪拌器上攪拌均勻后，超聲脫泡；取質量濃度20%的NaOH溶液和無水乙醇按4:1的體積比混合均勻制成200-300?mL凝結液；用注射器將殼聚糖和明膠混合溶液滴入凝結液中，形成直徑3-4?mm的微球，凝結一段時間后用去離子水洗滌殼聚糖微球至中性，濾干；

（4）將步驟（3）所得殼聚糖微球在30℃恒溫水浴震蕩的條件下，與質量濃度0.4%的京尼平溶液進行交聯，殼聚糖微球︰京尼平溶液的比g/mL計為1︰5，交聯時間為6h，洗滌除去游離的京尼平溶液；活化后的微球與步驟A中的游離酶酶液在4℃冰箱中靜置8h進行固定，每g微球加入2.5?mL酶液；最后，吸出未固定的游離酶酶液，并洗滌微球至表面無游離酶為止，所得固定化酶貯存在4℃冰箱中，備用。

2.用權利要求1方法制備的固定化酒用雙功能酶，其特征在于該固定化酒用雙功能酶催化尿素反應的最適溫度為40℃，最適pH為4.0，酶活半衰期為54?d；催化EC反應的最適溫度60℃，最適pH為4.5，酶活半衰期為45?d。

3.用權利要求1方法制備的固定化酒用雙功能酶的應用：其特征在于在內徑3?cm，長12?cm的層析柱中，黃酒的固定化酶加量為37.5?U/mL，調節流速1?mL/min，使400?mL的酒樣流過反應器，循環處理4次，尿素去除率能達到96.92%；在32℃、搖床轉速100?rpm的條件下，黃酒樣品中固定化尿素降解酶加酶量為0.04?U/mL黃酒時，固定化酒用雙功能酶處理黃酒20?h后，尿素去除率可達93.03%；同樣搖床條件下，樣品中固定化EC降解酶的加酶量為0.17?U/mL時，反應20?h后，EC去除率為56.60%。