[發(fā)明專(zhuān)利]一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310513221.4
• 申請(qǐng)日: 2013-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103525803A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田亞平;查小紅;楊廣明
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N11/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N11/10;C12N11/04;C12H1/15;C12R1/01
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

1.一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法，其特征在于將從普羅威登斯菌（Providencia?sp.）JNB815菌體細(xì)胞破碎液中提取的游離雙功能酶，經(jīng)殼聚糖吸附、明膠包埋和京尼平交聯(lián)，得固定化酒用雙功能酶；工藝為：

A．游離酶提取：

（1）菌種：采用普羅威登斯菌（Providencia?sp.）JNB815，本實(shí)驗(yàn)室篩選，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)：CGMCC?No.8326；

（2）游離酶的提取：菌種經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)獲得一定量菌體，將發(fā)酵液4℃、8000rpm離心5?min后，棄上清，所得菌體用去離子水洗滌兩次，pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，離心獲得全細(xì)胞；將獲得的全細(xì)胞用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發(fā)酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎條件為300?W、15min，破碎時(shí)間3?s、間隔時(shí)間3?s，處理量35?mL；破碎液在4℃、10000?rpm離心20?min，收集上清液，即為游離酶酶液；

B．固定化過(guò)程：

（3）稱(chēng)取殼聚糖3~5?g、明膠1~3?g，溶于100?mL?1%的乙酸中，置于磁力攪拌器上攪拌均勻后，超聲脫泡；取質(zhì)量濃度20%的NaOH溶液和無(wú)水乙醇按4:1的體積比混合均勻制成200-300?mL凝結(jié)液；用注射器將殼聚糖和明膠混合溶液滴入凝結(jié)液中，形成直徑3-4?mm的微球，凝結(jié)一段時(shí)間后用去離子水洗滌殼聚糖微球至中性，濾干；

（4）將步驟（3）所得殼聚糖微球在30℃恒溫水浴震蕩的條件下，與質(zhì)量濃度0.4%的京尼平溶液進(jìn)行交聯(lián)，殼聚糖微球︰京尼平溶液的比g/mL計(jì)為1︰5，交聯(lián)時(shí)間為6h，洗滌除去游離的京尼平溶液；活化后的微球與步驟A中的游離酶酶液在4℃冰箱中靜置8h進(jìn)行固定，每g微球加入2.5?mL酶液；最后，吸出未固定的游離酶酶液，并洗滌微球至表面無(wú)游離酶為止，所得固定化酶貯存在4℃冰箱中，備用。

2.用權(quán)利要求1方法制備的固定化酒用雙功能酶，其特征在于該固定化酒用雙功能酶催化尿素反應(yīng)的最適溫度為40℃，最適pH為4.0，酶活半衰期為54?d；催化EC反應(yīng)的最適溫度60℃，最適pH為4.5，酶活半衰期為45?d。

3.用權(quán)利要求1方法制備的固定化酒用雙功能酶的應(yīng)用：其特征在于在內(nèi)徑3?cm，長(zhǎng)12?cm的層析柱中，黃酒的固定化酶加量為37.5?U/mL，調(diào)節(jié)流速1?mL/min，使400?mL的酒樣流過(guò)反應(yīng)器，循環(huán)處理4次，尿素去除率能達(dá)到96.92%；在32℃、搖床轉(zhuǎn)速100?rpm的條件下，黃酒樣品中固定化尿素降解酶加酶量為0.04?U/mL黃酒時(shí)，固定化酒用雙功能酶處理黃酒20?h后，尿素去除率可達(dá)93.03%；同樣搖床條件下，樣品中固定化EC降解酶的加酶量為0.17?U/mL時(shí)，反應(yīng)20?h后，EC去除率為56.60%。