[發(fā)明專利]一種表達(dá)脂肪酶的黑曲霉菌株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310512640.6
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103555596A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王華明;徐娟;閆真;黃亦鈞
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N9/20;C12R1/685
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效重組表達(dá)脂肪酶的黑曲霉突變菌株。

背景技術(shù)

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油?；饷?，是指水解羧酸甘油三酯中酯鍵的酶。脂肪酶能催化甘油三酯來生成甘油二脂、單甘脂、脂肪酸和甘油。脂肪酶具有催化疏水性的油脂變成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在無機(jī)溶劑中能保持高催化活力和極強(qiáng)穩(wěn)定性。另外，脂肪酶對底物的廣譜性/特殊專一性，賦予了脂肪酶在食品油脂加工工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等工業(yè)的巨大應(yīng)用價值。脂肪酶已經(jīng)成為蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工業(yè)用酶。

脂肪酶是生物體內(nèi)一類重要的代謝酶，從催化特性看，它具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)性，且反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶的另外一個特征是可以在異相系統(tǒng)（如油、水界面）或有機(jī)相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反應(yīng)的進(jìn)行；而在有機(jī)相中，它卻能催化多種合成反應(yīng)：如酯化、酯交換、酯的醇解、酯的酸解等。脂肪酶的這些特性使其成為在手性化合物合成中重要的生物催化劑，多被用來催化一些酯類合成和轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在食品增香、脫脂加工、污水處理及化工產(chǎn)品中有著廣泛的應(yīng)用。然而，目前脂肪酶的生產(chǎn)效率仍然較低且生產(chǎn)成本也較高，因此需要對現(xiàn)有的脂肪酶的種類及生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。

脂肪酶廣泛存在于動物組織、植物種子和微生物體中。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，因此微生物來源的脂肪酶比動植物來源的脂肪酶具有更廣的作用pH、作用溫度范圍；以及高穩(wěn)定性、高活性和底物專一性。而且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品。已經(jīng)公布的適用于甘油三酯加工的不同來源的脂肪酶有33種，其中18種來自霉菌。但是，用來表達(dá)脂肪酶的重組菌株一直存在表達(dá)效率低下的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種黑曲霉突變菌株，所述黑曲霉突變菌株是由構(gòu)建得到的黑曲霉工程菌經(jīng)紫外誘變獲得的，其能大幅度提高脂肪酶的表達(dá)量，且不影響重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用效果。

本發(fā)明首先提供一種黑曲霉重組菌株，所述的重組菌株用于表達(dá)序列為SEQ?ID?NO:2的脂肪酶；

所述的黑曲霉重組菌株中轉(zhuǎn)入了攜帶有序列為SEQ?ID?NO:1的表達(dá)質(zhì)粒；

本發(fā)明一方面提供了一種黑曲霉突變菌株黑曲霉WLlip1（Aspergillus?Niger?WLlip1），已于2013年10月18日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏管理中心，保藏編號為CCTCC?NO:M2013478。

本發(fā)明的黑曲霉突變株用于生產(chǎn)脂肪酶。

本發(fā)明提供的黑曲霉突變菌株能高效重組表達(dá)脂肪酶，其蛋白表達(dá)量比突變前菌株提高了約40%，其發(fā)酵液的脂肪酶酶活高達(dá)5482U/mL，比突變前提高了78%，且突變后重組表達(dá)的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)并未因突變發(fā)生變化，最適作用pH均為9.5，最適作用溫度均為35℃。WLlip1突變株重組表達(dá)的脂肪酶對皮質(zhì)類污垢具有很強(qiáng)的去污效果，因此可廣泛應(yīng)用于洗滌劑領(lǐng)域。

附圖說明

圖1：黑曲霉XUJ-2菌株發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖；

其中，箭頭所指32kD附近可以看到清晰的蛋白條帶，即為重組脂肪酶。

圖2：黑曲霉突變株WLlip1發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖；

其中，泳道1為對照組XUJ-2菌株的脂肪酶表達(dá)情況，泳道2為突變株WLlip1的脂肪酶表達(dá)情況；箭頭所指32kD附近可以看到清晰的蛋白條帶，即為重組脂肪酶。

圖3：顯微鏡下觀察黑曲霉菌株形態(tài)變化；

其中，A為對照XUJ-2菌絲形態(tài)，B為突變株WLlip1菌絲形態(tài)。

圖4：本發(fā)明突變前后黑曲霉菌株發(fā)酵液中脂肪酶相對酶活-pH變化曲線。

圖5：本發(fā)明突變前后黑曲霉菌株發(fā)酵液中脂肪酶相對酶活-溫度變化曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合實例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook）等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不僅限于所提供的具體案例，而應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書基礎(chǔ)上，不需經(jīng)過創(chuàng)造性勞動就能擴(kuò)展的保護(hù)范圍。

實施例1：重組質(zhì)粒的構(gòu)建