[發明專利]一種重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白及其編碼基因和表達方法

有效

• 申請號: 201310511897.X
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103570836A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 馬永;王安良;章成昌;徐春林;陳晨;王耀方
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司;常州京森生物醫藥研究所有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/14;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
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技術領域

本發明屬于生物工程基因領域，涉及一種重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白及其編碼基因，以及其表達、純化和包涵體復性方法。

背景技術

干擾素(Interferon，IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質（主要是糖蛋白），是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。根據IFN的來源即動物種類、細胞類型、誘生劑的性質和誘生條件不同，可分為α、β、γ三種。其中，干擾素-β主要由成纖維細胞產生，在體內具有增強細胞表面HLAI、Ⅱ類抗原表達，提高血清新蝶吟和β₂-微球蛋白水平、增強NK細胞活力和ADCC作用以及外周淋巴細胞2’，5’-寡腺昔合成酶活性。臨床已將干擾素-β應用于病毒感染和腫瘤疾病的治療中。

我國是生豬養殖大國，豬圓環病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病等多種豬病毒性傳染病給養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前我國雖廣泛接種各種豬病疫苗，仍不能有效控制疾病流行。干擾素β具有較強的抗病毒效應及免疫調節活性，因此在獸藥領域中的應用越來越廣泛。在不同類型的干擾素中，干擾素β比干擾素α具有更好的抗SARS-CoV效果，而干擾素β在酸、堿、熱的穩定性也明顯優于干擾素α。然而，干擾素β種屬差異較大，僅依靠在活豬體內提取遠遠不能滿足市場的要求。動物用基因工程干擾素β無藥物殘留、無副作用，很受臨床獸醫和養殖戶的青睞，但是市場上多數類似藥物依然面臨著產量不足、質量層次不齊、價格昂貴等問題。

另一方面，作為小分子量蛋白，豬干擾素β1也與其他干擾素β一樣，存在血漿清除速度較快的缺陷，從而導致在臨床治療中需要重復多次用藥才能達到治療效果。同樣，半衰期短及用藥的頻繁也將成為使用豬干擾素β1治療豬病毒性疾病的瓶頸。IgG免疫球蛋白是人和動物體內的主要抗體，它在體內的半衰期約為20天。其穩定性是由于IgG的Fc片段可與新生Fc受體（FcRn）結合，避免IgG進入溶酶體中被降解。有鑒于此，本發明嘗試考慮在豬干擾素β1上增加IgG的Fc片段來構成融合蛋白，以提高豬干擾素β1體內半衰期，達到長效的目的。但是，一般來說，在小分子蛋白上增加IgG的Fc片段后都會使得蛋白的生物活性有很大程度的降低。由此，本發明的目的是提供一種既能保留豬干擾素β1原有活性，又可以延長體內半衰期的豬干擾素β1與Fc片段的融合蛋白。

然而，通過大腸桿菌表達的重組蛋白多為不溶解、無活性的細胞內聚集物，即包涵體。包涵體的復性是一個非常復雜的過程，如果復性條件不適宜將會出現分子內二硫鍵的錯配，分子間共價結合或疏水結合形成聚合體，一方面降低重組蛋白的比活率，造成產品質量不合格，同時又產生沉淀析出，影響得率。因此，本發明所要解決的另一個技術問題是采用合適的方法將大腸桿菌表達的蛋白包涵體復性為具有生物活性的蛋白。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足之處，通過密碼子優化的方式，提供一種可在大腸桿菌內高效表達的重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白以及其基因和表達、純化、復性方法。

本發明提供了重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括豬干擾素β1部分和Fc片段部分，其中，豬干擾素β1部分為豬干擾素β1胞外區的全部序列，Fc片段部分包括鉸鏈區、CH2區和CH3區，豬干擾素β1與Fc片段部分之間為直接融合。

其中的Fc片段選自人或動物的免疫球蛋白Fc，是Fc全長或是部分序列，Fc選自IgG、IgM、IgD、IgA，每種免疫球蛋白類型包括各亞型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。本發明的融合蛋白中的Fc片段部分特別優選來自豬的IgG1。

優選地，本發明的重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列，其中第2-165位氨基酸殘基為豬干擾素β1的胞外區序列，第166-395位氨基酸殘基為豬IgG1序列。

本發明提供了編碼上述所述重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白的基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。該序列是專為大腸桿菌表達系統進行密碼子優化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達。

本發明還提供了包含了上述所述編碼重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白的基因的質粒，所述的質粒優選為原核表達質粒，最優選為pET21b載體。

本發明還提供了包含有上述所述質粒的大腸桿菌菌株，優選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21（DE3）菌株。

本發明還提供了重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白在大腸桿菌表達方法，包括如下步驟：