[發明專利]一種基于競爭雜交反應同時檢測多種miRNA序列的比色方法

無效

• 申請號: 201310511246.0
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103529200A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 王建秀;張宇;馮城婷
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及一種基于競爭雜交反應同時檢測多種miRNA序列的比色方法，屬于miRNA序列檢測技術領域。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一組短的、不編碼蛋白質的內源性小RNA分子，其長度約為17～25個核苷酸(nt)。miRNA在生物體內的產生是一個復雜的過程。首先，pri-miRNA(初級miRNA)在細胞核內在Drosha酶的作用下形成具有發夾結構的pre-miRNA(前體miRNA)；然后，pre-miRNA被轉運到細胞質后在Dicer酶的作用下轉變成含有17～25個核苷酸的成熟miRNA。現在已有1000多種miRNA序列被檢測出，但大部分miRNA存在相似的序列以及功能。

目前，miRNA的檢測主要是基于雜交和擴增的方法。定性和定量的檢測技術主要有：Northern?blotting印跡法、聚合酶鏈式反應(PCR)、微陣列芯片(microarray)、滾環擴增等，這些方法都是通過堿基互補配對原理進行雜交，然后結合分離、標記以及熒光、電化學等方法對miRNA進行分析檢測。其中，Northern?blotting印跡法是一種半定量的檢測方法，步驟繁瑣且耗時、靈敏度不高。PCR技術能夠對miRNA進行高靈敏、高特異性的定量檢測，但該方法步驟繁瑣，需要對miRNA進行預處理。Microarray法雖然在短時間內能快速、高通量地檢測大量miRNA序列，但其成本高，無法區分堿基相差很小的同族miRNA序列。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于同時檢測多種miRNA序列的方法，該方法簡單、快速、靈敏度高、選擇性好，且無需對實際樣品標記。

一種基于競爭雜交反應同時檢測多種miRNA序列的比色方法，將多種氨基修飾的DNA序列分別組裝到微孔板上，將微孔封閉；隨后將與微孔中氨基修飾的DNA序列相匹配的生物素修飾的miRNA溶液和待測靶點miRNA序列溶液混合滴加在孔板表面并發生競爭雜交反應；最后將親和素標記的多聚辣根過氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根過氧化物酶催化過氧化氫氧化TMB的顯色反應，從而對靶點miRNA序列定量。

所檢測的三種存在于膠質瘤血清中的miRNA序列為：

miR-182：5'-UUU?GGC?AAU?GGU?AGA?ACU?CAC?ACU-3'；

miR-185：5'-UGG?AGA?GAA?AGG?CAG?UUC?CUGA-3'；

miR-381：5'-UAU?ACA?AGG?GCA?AGC?UCU?CUGU-3'。

miR-182對應的氨基修飾的DNA序列為

3'-AAA?CCG?TTA?CCA?TCT?TGA?GTG?TGA?TTT?TT-(CH₂)₆NH₂-5'；

miR-185對應的氨基修飾的DNA序列為

3'-ACC?TCT?CTT?TCC?GTC?AAGGACT?TTT?TT-(CH₂)₆NH₂-5'

miR-381對應的氨基修飾的DNA序列為

3'-ATA?TGT?TCC?CGT?TCG?AGA?GACA?TTT?TT-(CH₂)₆NH₂-5'。

上述方法中微孔中分別滴加60μL的1nM的氨基修飾的DNA溶液，靜置過夜，用PBS緩沖液沖洗。氨基修飾的DNA組裝后在每個微孔中分別滴加180μL質量濃度為2%的BSA溶液，室溫下靜置2.5h后，用PBS緩沖液沖洗。生物素修飾的miRNA和待測靶點miRNA序列配制成的混合溶液中生物素修飾的miRNA182濃度為0.5nM，生物素修飾的miRNA381和miRNA185濃度均為1nM。所述的競爭雜交反應在37℃下反應2.5-3h。競爭雜交反應完成后在每個微孔中分別滴加SA-Poly-HRP溶液（每孔滴加60μL，SA-Poly-HRP購自RB-Sigma，貨號S2438-250UG，采用PBS緩沖液按體積比為1:500進行稀釋得到），室溫下靜置1h后，采用PBS緩沖液沖洗。將100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H₂O₂溶液先后加入到衍生后的微孔中，室溫下反應10min后，再加入120μL2mol/L?HCl溶液終止顯色反應；最后將酶標板放入酶標儀中，在450nm下檢測吸光度值。