[發明專利]一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201310509015.6
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103571952A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 康相濤;韓瑞麗;楊朋坤;王丹丹;李轉見;田亞東;蔣瑞瑞;孫桂榮;呂世杰;李國喜;閆峰賓;王彥彬;劉小軍;許殿明;李孝法;索智勇;曹向陽
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明具體涉及一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物，以及包含該引物的試劑盒及檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

烏骨雞是聞名中外的藥用家禽，1874年被國際上承認為標準品種，它具有特殊的藥用、營養及觀賞價值。研究表明，烏雞的藥用價值主要在于其黑色素的作用，烏膚性狀是消費者對黑色素表達最直接的判定。

烏膚基因座Fm是影響雞烏膚性狀的基因座位，其座位上的顯性等位基因Fm是引起雞類纖維色素增生（fibromelanosis）的原因，從而使攜帶此基因型的個體全身皮膚呈現烏色。目前，已確認雞烏膚基因基因座編碼ATP5E（ATP?synthase?epsilonsubunit），TUBB1（tubulin,beta1），SLMO2（slowmo?homolog2）和EDN3（endothelin3）四個蛋白。研究表明：雞烏膚位點等位基因是由于ATP5E（ATP?synthase?epsilonsubunit），TUBB1（tubulin，beta1），SLMO2（slowmo?homolog2）和EDN3（endothelin3）等基因拷貝數增加造成的。其中，Endothelin3（EDN3）蛋白，是影響色素細胞發育的一個主要因素。該基因座上EDN3基因拷貝數的變化導致色素細胞過量生成，而過量的色素細胞產生大量的黑色素。顯性等位基因Fm是EDN3等四個基因相對拷貝數為2的基因型，隱性等位基因fm是EDN3等四個基因相對拷貝數為1的基因型。對于拷貝數變異的基因片段來說，常規PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳無法對純合子和雜合子進行分型，必須使用熒光定量PCR的方法對拷貝數變異進行鑒定，而目前仍缺乏一種行之有效的鑒定方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物。

同時，本發明還提供一種用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒。

最后，本發明還提供一種檢測雞烏膚位點基因型的方法。

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：

一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物，包括引物對P，

所述的引物對P為：

上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’（如SEQ?ID?No.1所示）；

下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’（如SEQ?ID?No.2所示）。

一種用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒，主要包括引物對P：

上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’；

下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。

優選的，一種用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒，還包括熒光定量PCR2×緩沖液、滅菌超純水和熒光定量標準品。

所述的熒光定量PCR2×緩沖液主要包括5U/μL?Taq?DNA?Polymerase，10×Buffer，25mM?MgCl₂，2mM?dNTPs，SYBR?Green?I。

所述的熒光定量標準品為白膚雞全血基因組DNA，濃度分別為80，40，20，10，5，2.5ng/μL。

一種檢測雞烏膚位點基因型的方法，包括以下步驟：以包含EDN3基因的待測雞全血基因組DNA為模板，以引物對P為引物進行熒光定量PCR擴增，擴增片段的DNA序列如SEQ?ID?No.3所示。該序列的全長為134bp，是位于雞烏膚位點EDN3基因上的分子標記，能夠檢測雞烏膚基因位點EDN3基因是否存在拷貝數變異。

所述的熒光定量PCR擴增反應體系為：熒光定量PCR2×緩沖液10μL，ddH₂O7μL，P-F0.5μL，P-R0.5μL，DNA模板2μL。

所述的熒光定量PCR擴增反應程序為：95℃預變性2min；40個循環：95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min；20℃保存。

具體的，一種檢測雞烏膚位點基因型的方法，還包括以下步驟：利用標準曲線求待測雞EDN3基因的相對拷貝數，根據其相對拷貝數鑒定雞烏膚位點的基因型。

所述的標準曲線的制作方法為：以白膚雞全血基因組DNA作為熒光定量標準品，濃度分別為80，40，20，10，5，2.5ng/μL，以引物對P為引物進行熒光定量PCR擴增，以上述六個標準品的Ct值為縱坐標，以濃度的對數值為橫坐標，建立標準曲線，求得標準曲線方程。