[發明專利]焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物和方法

有效

• 申請號: 201310508383.9
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103540671A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 房保海;金瑩;于仕超;孫濤;賈俊濤;姜英輝;譚樂義
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物，其特征在于：

正向引物序列為SEQ?ID?NO?1；

反向引物序列為SEQ?ID?NO?2；

測序引物序列為SEQ?ID?NO?3。

2.一種焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的方法，其特征在于，包括下列步驟：

首先依據花生Ara?h?6基因設計特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的脫氧核糖核酸（DNA），然后分別以花生Ara?h?6基因的特異性引物進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為239?bp，則制備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最后根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有花生過敏原成分；花生Ara?h?6基因PCR及測序引物為：

正向引物序列為SEQ?ID?NO?1；?

反向引物序列為SEQ?ID?NO?2；5’進行生物素標記；

測序引物序列為SEQ?ID?NO?3；

花生Ara?h?6基因的目標序列為SEQ?ID?NO?4；擴增片段長度為239?bp；

具體包括下列步驟：

（一）DNA?模板的制備?

樣品處理：取花生等試驗材料，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備用；

DNA模板的提取：取?200?mg?樣品于?50?mL?離心管中，加入?5?mL?CTAB?提取緩沖液和?20?μL?蛋白酶K?溶液，充分混勻；?65?℃振蕩過夜后，13?000?g?離心?20?min，轉移上清液700μL至新的離心管中；加入?700?μL?三氯甲烷后用力振蕩，13?000?g?離心?5?min，?將上清轉移到新的2?mL?eppendorf離心管中；加入?2?倍體積的?CTAB?沉淀液，室溫靜置?60?min，13?000?g?離心?5?min，棄去上清；加入?350?μL?NaCl?溶液將沉淀進行懸浮，再加入350?μL?三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13?000?g?離心?10?min，轉移上清到新的2?mL?eppendorf離心管中后加入?0.8?倍體積的異丙醇，室溫放置?60?min，13?000?g?離心?10?min，棄去上清；加入?500?μL?70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100?μL?TE?溶液中，立即使用或-20?℃保存備用；

（二）PCR擴增

PCR反應體系：2×GoTaq?Master?Mix?25?μL，生物素標記上游引物和下游引物各10?pmoL，DNA模板2μL，加無菌去離子水至50μL；擴增反應參數：94℃預變性5?min，94℃變性20?s，58℃退火30?s，72℃延伸20?s，50個循環，72?℃延伸5?min，4?℃保溫；取反應產物5?μL上樣，2％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其余擴增產物用于焦磷酸測序；

（三）焦磷酸測序

將PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose?beads?3?μL和Binding?Buffer?47?μL，常溫混勻10?min；

打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum?Prep?T001)在超純水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠，分別在70％乙醇中清洗5～10s、Denaturation?Buffer中變性5?s、Washing?Buffer中清洗5～10s，關閉真空泵，將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物0.3?μmol/L和Annealing?Buffer共45μL；

將96孔測序板置80?℃溫箱2?min，冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應，設定程序，堿基的加入為ATCG?6-10個重復，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。