[發明專利]一種肺炎克雷伯菌的固定化小球的制備方法

有效

• 申請號: 201310508287.4
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103525802A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 趙曉祥;南曉梅;高瑩;龔娟;尹珊珊
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08;C02F3/34
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于微生物固定化技術領域，特別涉及一種肺炎克雷伯菌（Klebsiella?pneumoniae）的固定化小球制備方法。

背景技術

隨著近些年水體富營養化現象的加劇，脫氮成為廢水處理研究中的重要課題。在廢水生物處理系統中，主要是利用微生物的硝化-反硝化作用來去除廢水中氨氮對環境的污染，其中硝化作用是由亞硝酸菌和硝酸菌來共同完成，首先亞硝化菌將氨氮轉化為亞硝態氮，然后硝酸細菌將亞硝態氮轉化為硝態氮，完成整個硝化過程。在此過程中，氨氮的去除是廢水處理中的重要一環，因此亞硝酸細菌的硝化作用是脫氮過程中決定后續反應速率的進行，控制著硝化作用的整個過程。

微生物固定化技術直接從固定化酶技術衍生而來，為完善和提高游離微生物體系性能而發展起來的。它是通過一定的技術手段將菌體固定在載體上，避免菌體流失，以提高菌體的去除效率為目的的一種處理方式。固定化微生物的制備方式一般可以分為共價結合法、交聯法、吸附法和包埋法。目前，在有關固定化硝化細菌處理廢水的研究中，一般采用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉(SA)作為固定化載體材料，而采用聚乙二醇(PEG)和海藻酸鈉(SA)作為固定化載體材料卻鮮少報道。聚乙二醇無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，并與許多有機物組份有良好的相溶性。在化妝品、制藥、化纖、橡膠、塑料、造紙金屬加工及食品加工等行業中均有著廣泛的應用。海藻酸鈉是一種天然多糖，具有藥物制劑輔料所需的穩定性、溶解性、粘性和安全性。將二者混合后作為固定化復合載體材料，有利于提高固定化小球的含水率以及支架孔徑。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種肺炎克雷伯菌的固定化小球的制備方法，該方法通過用肺炎克雷伯菌制備菌懸液、以聚乙二醇和海藻酸鈉作為復合載體，制備了肺炎克雷伯菌固定化小球，該固定化小球可用于氨氮廢水處理。

本發明的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的制備方法，包括：

（1）菌懸液制備

將肺炎克雷伯菌接種于液體富集培養基中，搖床培養后得到對數生長期的菌體，離心后，棄去上清液，將菌體用生理鹽水洗滌，反復離心4～5次，用生理鹽水稀釋后得到菌懸液；

（2）復合載體的制備

將聚乙二醇和海藻酸鈉加入去離子水中，高溫滅菌后使其完全溶解后，冷卻到28～32℃，得到固定化載體混合水溶液，作為復合載體；

（3）肺炎克雷伯菌固定化小球的制備

將上述菌懸液和固定化載體混合水溶液混合后攪拌均勻后，-5～5℃下用注射器滴加到不斷攪拌CaCl₂溶液中，形成2-3mm的固定化小球，固化交聯5～6h后用生理鹽水沖洗4～5次，即得肺炎克雷伯菌固定小球，4℃低溫保存備用。

步驟（1）中所述的搖床培養的溫度為30℃，時間為24h。

步驟（1）中所述的離心為于7000r/min離心15min。

步驟（2）中所述的聚乙二醇、海藻酸鈉和去離子水的用量比為6g：4g：100mL。

步驟（2）中所述的高溫滅菌具體操作為于121℃，105～110kPa滅菌20min。

步驟（3）中所述的菌懸液與固定化載體混合水溶液的體積比為1:1。

步驟（3）所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球的粒徑范圍為2～3mm。

步驟（3）所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球應用于氨氮廢水處理。

本發明中，聚乙二醇和海藻酸鈉作為復合包埋材料固定化肺炎克雷伯菌，以CaCl₂溶液作為交聯劑，生理鹽水作為表面處理劑來制備肺炎克雷伯菌固定化小球。

本發明的肺炎克雷伯菌固定化小球可用于氨氮廢水處理，處理條件是固定化小球在30℃，轉速150r/min搖床中，投入氨氮模擬廢水中培養7d，每隔24h取樣測定氨氮含量,經過7d的降解，氨氮含量由最初的10mg/L降解到1.55mg/L，去除率為84.5%。

本發明中所述的肺炎克雷伯菌（Klebsiella?pneumoniae）已于2013年9月13日保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC?NO.8182。

有益效果：

本發明的制備方法簡單，得到的肺炎克雷伯菌固定化小球可用于氨氮廢水處理。

附圖說明

圖1是含肺炎克雷伯菌的復合載體固定化小球外型照片；