[發明專利]一種生物羊膜及其制備方法

有效

• 申請號: 201310508091.5
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103520780A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 李晶
• 申請（專利權）人: 陜西瑞盛生物科技有限公司
• 主分類號: A61L31/12
• 分類號: A61L31/12;A61L31/00;A61L31/16;A61L31/04;B32B9/02
• 代理公司: 西安睿通知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 61218
• 代理人: 蔡龍寶

技術領域

本發明屬于醫用生物材料技術，具體涉及一種生物羊膜及其制備方法。

背景技術

組織粘連是結締組織纖維帶與相鄰的組織或器官結合在一起而形成的異常結構，可引起各種術后并發癥：例如，肌腱修復術后粘連，嚴重的影響手術部位功能的恢復，甚至會造成局部功能的喪失。

羊膜，是人胎膜的內層，包含人體中最厚的基底膜及無血管的間質，羊膜免疫原性低，具有減輕炎性反應、抑制纖維組織增生等作用，可作為一種理想的組織工程修復材料。

專利CN1369555A和CN102327640A分別使用胰蛋白酶、TBS-SDS（含有十二烷基硫酸鈉的TBS緩沖液）等試劑對羊膜進行脫細胞，制備得到的羊膜材料比較薄、易卷曲、黏附性較差、使用時易滑動脫落。為了克服上述缺點，專利CN100368534C采用交聯技術制備復合生物衍生羊膜以改善其可操作性，但處理時使用了氯仿、甲醇、戊二醛等多種有機試劑，處理強度大，經過脫脂等多個步驟后對羊膜的天然結構破壞很大，造成膠原束排列不規則，膠原纖維斷裂，同時大量的生物活性因子失活試劑殘留風險高，且。針對生物衍生羊膜的不足，專利CN1943796A公開了一種輻照交聯多孔網狀脫細胞羊膜水凝膠輔料的制作方法，提出了水凝膠敷料的概念，但采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）對羊膜進行脫細胞，極易破壞羊膜的天然結構，造成膠原纖維斷裂、降低材料的力學性能，而且該專利中使用了高劑量的輻照交聯和輻照消毒步驟，輻照交聯過程中往往會伴隨著一些副反應的發生降低產品的安全性，兩次輻照過程會大大破壞天然羊膜的空間膠原結構。專利CN101040616A將羊膜與生長因子浸泡后制得藥物羊膜，但仍未改善單層羊膜較薄、易卷曲的操作缺點，而且浸泡后的生長因子僅僅附著在羊膜表面，緩釋性較差。

發明內容

本發明的目的在于克服現有羊膜防粘連材料及制備工藝的不足，提供一種具有緩釋功能的生物羊膜及其制備方法。

本發明是這樣實現的：

本發明所提出的生物羊膜，其特征在于，具有三層結構，自上而下分別為緩釋層、羊膜層、膠原層。其中，緩釋層是由膠原蛋白和生物活性因子組成，較薄，約為0.5～1.0μm；羊膜層為經過脫細胞處理的羊膜，保留了羊膜天然的致密膠原結構；膠原層是膠原蛋白組成，與緩釋層相比較厚，約為10.0～50.0μm。三者之間通過冷凍干燥復合而成。

本發明提出的緩釋生物羊膜的制備方法，其主要步驟如下：

步驟一、原料預處理：將新鮮羊膜去除表面血污，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水或純化水清洗干凈；

步驟二、病毒滅活：將步驟一的羊膜，室溫25℃，浸泡于75%乙醇溶液中1～3h，或浸泡于0.1%～0.5%過氧乙酸溶液中10～30min，再用純化水清洗3～5次；

步驟三、脫細胞處理：將步驟二的羊膜，室溫25℃，置于高滲溶液中震蕩0.5～3h后，用純化水清洗干凈；再采用純化水室溫震蕩0.5～3h。重復1～5次，制備獲得羊膜層；

所述高滲溶液為1M～5M?NaCl與0.01M～0.5M?NaOH的混合溶液。

上述三個步驟實現了羊膜脫細胞基質即羊膜層的制備，對羊膜進行前處理后選用了滅活的步驟，保證產品的生物安全性。通過溶脹作用破壞基質中的上皮細胞，達到去除細胞抗原性的目的。上述各步驟工藝中沒有采用酶、去污劑等破壞程度強烈的工藝，充分保留了羊膜細胞外基質中天然的致密結構。

步驟四、膠原層的制備：將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，-20℃下預凍2h后放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥4～8h；

本步驟將羊膜和膠原蛋白復合制成復合生物羊膜，通過冷凍復合膠原過程增加了產品的厚度，改善了單層羊膜較薄、易卷曲的缺點。

步驟五、緩釋層的制備：制備具有抑制炎癥、促進傷口愈合的活性因子bFGF、EGF的一種或兩種因子任意濃度混合的膠原溶液，兩種活性因子的濃度范圍均為2000ng/ml～20000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃預凍2h后冷凍干燥6～12h。冷凍過程使膠原形成具有一定空隙的空間結構，而活性因子能夠附著在支架空隙中形成緩釋作用，最終制備得到生物羊膜。