[發明專利]用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應用

無效

• 申請號: 201310506902.8
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103525951A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 徐黎明;盧彤巖;劉淼
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應用。

背景技術

傳染性造血器官壞死病（infectious?haematopoietic?necrosis，IHN）是由傳染性造血器官壞死病毒（Infectious?haematopoietic?necrosis?virus，IHNV）引起的一種常見的危害鮭鱒魚類的急性病毒性傳染病。自從上世紀50年代在美國首次暴發以來，IHNV已經擴散至歐洲、澳洲、亞洲等十余個國家。IHNV可造成鮭鱒魚魚苗近100%的死亡率，對世界的鮭鱒魚養殖業造成了巨大的經濟損失。因此，實用、快速、靈敏、準確的IHNV檢測技術的建立在IHN早期診斷、水產品衛生質量監督、疫情監測等方面具有重要的意義。目前，世界動物衛生組織推薦的IHN的幾種診斷方法包括細胞培養分離方法、免疫學方法（中和試驗法、間接熒光抗體法和ELISA法）和分子生物學方法（PCR法、PCR探針和序列測定法）。PCR方法是目前最常用的快速檢測方法，已經有以PCR技術為依托的商業化的IHNV檢測試劑盒，這些檢測試劑盒需要專門的儀器或者對PCR產物進行凝膠電泳與紫外線分析才能確定檢測結果。

環介導等溫擴增（loop?mediated?isothermal?amplification，LAMP）技術是2000年Notomi等在PCR基礎上創建的另外一種形式的核酸擴增技術。與PCR技術相比，兩者最大的差異在于靶基因引物的設計上。其中，PCR只使用一對與靶基因兩端序列互補的上下游引物，而LAMP則針對靶基因的6個不同區域，設計4種特異引物——內側引物對和外側引物對，必要時再加上環形引物對，對靶基因進行擴增，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行擴增反應，因此其特異性和敏感性均比PCR更高。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增引物組。

本發明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增引物組，具體可為引物組A或引物組B；所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；

所述引物1（F3）、所述引物2（B3）、所述引物3（FIP）、所述引物4（BIP）、所述引物5（Loop-F）和所述引物6（Loop-B）的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比可為1：1：8：8：4：4。所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比可為1：1：8：8。

在本發明的一個實施例中，所述引物1（F3）和所述引物2（B3）在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為0.2μM；所述引物3（FIP）和所述引物4（BIP）在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為1.6μM；所述引物5（Loop-F）和所述引物6（Loop-B）在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為0.8μM。

所述引物組中，引物1（F3）和引物2（B3）組成外側引物對；引物3（FIP）和引物4（BIP）組成內側引物對；引物5（Loop-F）和引物6（Loop-B）組成環形引物對。序列1由20個核苷酸組成，序列2由20個核苷酸組成，序列3由45個核苷酸組成，序列4由46個核苷酸組成，序列5由18個核苷酸組成，序列6由20個核苷酸組成。

本發明的又一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑。

本發明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑，具體可包括反轉錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs和所述引物組。

當所述引物組為所述引物組A時，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述反轉錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴增試劑中的配比可為5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：20pmol：20pmol：25mmol：5nmol：10U：8U。