[發(fā)明專利]應(yīng)用RPA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)品系特異性鑒定

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310506259.9
• 申請(qǐng)日: 2013-10-24
• 公開（公告）號(hào): CN103525936A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金蕪軍;宛煜嵩;徐潮;李亮;苗朝華;黃衛(wèi)紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京知本村知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11039
• 代理人: 劉江良

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Recombinase?Ploymerase?Amplification,?RPA）鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻特異性方法，及其相應(yīng)的引物和探針組合。?

背景技術(shù)

目前DNA擴(kuò)增是核酸檢測(cè)的主要方法，常用的PCR檢測(cè)需要精密的儀器以及繁瑣的試驗(yàn)程序，難以滿足非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。近年來(lái)，核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，與傳統(tǒng)PCR相比核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要昂貴的PCR儀，可在短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增出目的片段，具有簡(jiǎn)便，快速，靈敏等優(yōu)點(diǎn)。RPA技術(shù)是模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制、基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增原理發(fā)展而來(lái)，利用重組酶和引物形成微絲在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí),?在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開始配對(duì)形成復(fù)制所需自由的3’羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，形成新的DNA互補(bǔ)鏈反應(yīng)產(chǎn)物也是以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA反應(yīng)所需引物長(zhǎng)度通常為30-35nt。引物設(shè)計(jì)時(shí)為了避免形成引物內(nèi)部及之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度的增加也使引物設(shè)計(jì)及選擇難度增加，引物序列的設(shè)計(jì)與選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。在RPA擴(kuò)增體系中加入一個(gè)熒光標(biāo)記的探針便可實(shí)現(xiàn)模板擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，該探針中部?jī)蓚€(gè)T堿基上各標(biāo)記一個(gè)熒光集團(tuán)（FAM和BHQ1），在兩個(gè)集團(tuán)之間有一個(gè)脫堿基位點(diǎn)（dSpacer），該位點(diǎn)可被一種來(lái)自大腸桿菌的核酸外切酶識(shí)別，該酶具有3’-5’外切酶活性，可以使兩個(gè)熒光集團(tuán)分離，從而使熒光信號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物的累積相同步。結(jié)合一個(gè)便攜式的熒光擴(kuò)增檢測(cè)儀便可在10-20分鐘內(nèi)檢測(cè)到熒光曲線。RPA技術(shù)極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了反應(yīng)程序，與DNA快速提取技術(shù)相結(jié)合使野外檢測(cè)成為可能，具有廣泛的應(yīng)用前景。?

PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的方法有篩選檢測(cè)，基因特異性檢測(cè)，構(gòu)建特異性檢測(cè)和轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)。由于外源基因在受體基因組插入位點(diǎn)的唯一性特征，因此根據(jù)外源插入DNA序列與水稻基因組的連接區(qū)域設(shè)計(jì)RPA引物進(jìn)行檢測(cè)具有很高的特異性，可特異性地檢測(cè)該轉(zhuǎn)化體及其衍生品系。?

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻科豐6號(hào)已經(jīng)進(jìn)入安全評(píng)價(jià)階段，具有良好的商業(yè)化前景。目前我國(guó)尚未批準(zhǔn)科豐6號(hào)的商業(yè)化種植，為防止轉(zhuǎn)基因水稻未經(jīng)安全批準(zhǔn)進(jìn)入生產(chǎn)流通環(huán)節(jié)，迫切需要建立快速簡(jiǎn)便檢測(cè)方法，用于市場(chǎng)監(jiān)管和例行監(jiān)測(cè)。?

目前，已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)方法中，主要是利用PCR儀在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)的檢測(cè)，該方法還不能進(jìn)一步滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外目前還沒(méi)有利用RPA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)做品系特異性鑒定。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述領(lǐng)域的空白，本發(fā)明提供了準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)品系特異性的RPA檢測(cè)方法。?

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種用于通過(guò)重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻科豐6號(hào)的引物，其正向引物序列如SEQ?ID?No.1所示，反向引物序列如SEQ?ID?No.2所示，探針序列如SEQ?ID?No.3所示。?

本發(fā)明還提供一種通過(guò)重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻科豐6號(hào)的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物和探針。?

本發(fā)明還提供一種通過(guò)重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻科豐6號(hào)的方法：提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行熒光快速檢測(cè)，如果得到明顯的擴(kuò)增曲線，則證明所檢樣品為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻科豐6號(hào)。實(shí)施步驟為：向RPA擴(kuò)增試劑盒推薦反應(yīng)的50μL擴(kuò)增體系中加入引物各2μL（10μmol/L），探針0.5μL（10μmol/L），模板DNA?50ng。RPA擴(kuò)增檢測(cè)儀（或熒光定量PCR儀）39攝氏度反應(yīng)20分鐘。?

本發(fā)明方法是根據(jù)外源插入DNA序列與水稻基因組的連接區(qū)域設(shè)計(jì)大量RPA特異性引物，從中篩選出一套可快速有效檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)成分的引物及探針組合。利用該對(duì)引物進(jìn)行熒光快速檢測(cè)，以轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)基因組DNA為模板可以得到明顯的擴(kuò)增曲線，而非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63和其他轉(zhuǎn)基因水稻品系華恢1號(hào)等4種水稻材料的基因組DNA為模板擴(kuò)增均沒(méi)有擴(kuò)增曲線。將模板用水稀釋至10000,2000,500,100,50個(gè)拷貝，結(jié)果顯示可以檢測(cè)到100個(gè)拷貝的靶標(biāo)分子，證明該方法具有較高的靈敏度，這是現(xiàn)有技術(shù)不能達(dá)到的靈敏水平。本發(fā)明首次提供轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻科豐6號(hào)品系特異性的RPA檢測(cè)方法。該方法使生物技術(shù)產(chǎn)品在準(zhǔn)確、快速檢測(cè)方面的能力得到提高。?

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附圖說(shuō)明