[發(fā)明專利]慶笙紅球菌及其在制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310504948.6
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN103589665A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 鄭裕國;孫麗慧;朱斌斌;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業(yè)大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/62;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發(fā)明涉及一株新的菌株——慶笙紅球菌（Rhodococcus?qingshengii）ZJB-12028，以及該菌株在微生物不對稱還原4-氯乙酰乙酸乙酯制備阿托伐他汀關鍵手性中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應用。

（二）背景技術

(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（Ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate,(S)-CHBE）是一種重要的手性藥物中間體，可用于合成他汀類藥物—羥甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）還原酶的競爭性抑制劑，可以抑制肝臟中的膽固醇的合成，從而降低血液中膽固醇的含量，降低心腦血管疾病的發(fā)病機率，其藥物商品名立普妥（阿托伐他汀鈣）是美國第一個年銷量超過一百億美元的藥物，目前也是全球最高銷量的藥物。另外，(S)-CHBE還可以轉化生成1，4-二氫吡啶類β-阻滯劑，后者是一種抗高血壓藥物的有效成分。因此，制備光學活性(S)-CHBE備受研究者的關注。以下是(S)-CHBE分子結構式：

(S)-CHBE的制備方法可以分為外消旋體拆分法和不對稱催化合成法。由于外消旋體拆分的方法制備效率不高，理論收率僅為50％，且產(chǎn)物的分離純化困難，因此，對于外消旋體的手性拆分制備(S)-CHBE意義不大。與拆分法相比較而言，采用不對稱合成(S)-CHBE受到了更多的關注。以潛手性底物4-氯乙酰乙酸乙酯（Ethyl4-chloroacetoacetate，COBE）為原料，不對稱催化合成單一手性對映體(S)-CHBE可以解決拆分法獲得(S)-CHBE中的過程復雜，單一對映體過量值低等問題，同時由于底物COBE價格便宜，容易合成，因此不對稱合成法是最經(jīng)濟有效的合成(S)-CHBE方法。

以COBE為原料不對稱合成制備(S)-CHBE，可分為化學催化法和生物催化法兩類?；瘜W催化法是采用手性的釕化合物（例如RuX₂[(S)-BINAP]）作為催化劑不對稱加氫還原，產(chǎn)物的e.e.值可達97%以上，但這種方法需要高壓加氫，對反應器要求較高，而且所用催化劑價格昂貴，因此生產(chǎn)成本較高。而采用的生物催化劑無需苛刻的反應條件，也不需要昂貴的催化劑，因此有較好的應用前景。生物催化過程中，采用純酶催化需要添加昂貴的輔酶，因此，大規(guī)模的生產(chǎn)通常采用具備輔酶再生系統(tǒng)的微生物細胞作為催化劑。生物法羰基不對稱還原制備(S)-CHBE具有反應條件溫和，產(chǎn)物單一，立體選擇性高，在未來的綠色化學的發(fā)展過程中有重要的利用開發(fā)價值。

（三）發(fā)明內容

本發(fā)明目的是提供一株新菌株——慶笙紅球菌（Rhodococcus?qingshengii）ZJB-12028，及其在羰基不對稱還原制備(S)-CHBE中的應用，該菌株穩(wěn)定性好，立體選擇性嚴格，產(chǎn)物光學純度高。

本發(fā)明采用的技術方案是：

慶笙紅球菌（Rhodococcus?qingshengii）ZJB-12028，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏日期2013年9月4日，保藏編號CCTCC?NO:M2013390。

該新菌株特征如下：

菌落形態(tài)：28℃條件下培養(yǎng)24h，菌落呈圓形，中央隆起呈凸鏡狀，直徑2～3mm，乳白色，不透明，表面光滑濕潤，邊緣整齊，略帶鋸齒狀，易挑起。

生理生化特征：革蘭氏陽性，接觸酶陽性，利用APICoryne自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株進行了生理生化檢測表明菌株ZJB-12028為紅球菌屬（Rhodococcus），具體特征見表1。

表1：菌株ZJB-12028的生理生化鑒定結果

Notes:+,positive;-,negative;

16S?rDNA序列鑒定：以提取到的細胞總DNA為模版，利用通用引物P1和P2擴增菌株的16S?rDNA基因，再將PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。菌株ZJB-12028經(jīng)PCR擴增獲得一段長約為1.5kb的片段，經(jīng)測序確認該菌株16S?rDNA的擴增產(chǎn)物實際長度為1422bp，序列如SEQ?ID?No.1所示：