[發(fā)明專利]一種檢測(cè)牛PNPLA3基因單核苷酸多態(tài)性的方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310504648.8
• 申請(qǐng)日: 2013-10-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103805692B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳宏;王梓年;藍(lán)賢勇;雷初超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司61200
• 代理人: 蔡和平

1.一種快速檢測(cè)秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于：以包含PNPLA3基因的待測(cè)牛基因組DNA為模板，以引物對(duì)P1、P2、P3、P4、P5為引物，PCR擴(kuò)增秦川牛PNPLA3基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)27個(gè)多態(tài)位點(diǎn)；從中挑選錯(cuò)義突變位點(diǎn)4個(gè)，并針對(duì)這4個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI，進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測(cè)牛的PNPLA3基因片段，用限制性內(nèi)切酶BglI、RsaI、BmgT120I和MspI分別酶切對(duì)應(yīng)引物對(duì)P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定秦川牛PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的單核苷酸多態(tài)性；

所述的引物對(duì)P1為：

上游引物：5'-CTTCACAAGCCAGACCCT-3'

下游引物：5'-GCTGTATGATAGCCCCTA-3’

所述的引物對(duì)P2為：

上游引物：5'-GACCATTTCTCGTTACCA-3'

下游引物：5'-AGGATGAAGACCCCACTG-3’

所述的引物對(duì)P3為：

上游引物：5'-GCATGTGGCAGTCCTGAG-3'

下游引物：5'-TGTTGCTGTTGGTCCGTC-3’

所述的引物對(duì)P4為：

上游引物：5'-TTTGTCACGAGCGGAATG-3'

下游引物：5'-GGAAAGGAGACAGAGCAA-3’

所述的引物對(duì)P5為：

上游引物：5'-ATTCCTTCCCTGCTGACT-3'

下游引物：5'-AAACCTGAGGGAGCAATG-3’

所述的引物對(duì)P2-BglI為：

上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'

下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’

所述的引物對(duì)P2-RsaI為：

上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'

下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’

所述的引物對(duì)P3-BmgT120I為：

上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'

下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’

所述的引物對(duì)P3-MspI為：

上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'

下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

引物對(duì)P2-BglI：

95℃預(yù)變性5min；34個(gè)循環(huán)95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；

引物對(duì)P2-RsaI：

95℃預(yù)變性5min；34個(gè)循環(huán)95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；

引物對(duì)P3-BmgT120I：

95℃預(yù)變性5min；34個(gè)循環(huán)95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；

引物對(duì)P3-MspI：

95℃預(yù)變性5min；34個(gè)循環(huán)95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3.0％，以120V電泳1.25個(gè)小時(shí)。