[發明專利]IL-17F基因實時熒光PCR檢測引物及試劑盒

有效

• 申請號: 201310504426.6
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103498007A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 周世亮
• 申請（專利權）人: 周世亮
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

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技術領域

本發明屬于基因表達領域，尤其是涉及IL-17F基因PCR檢測引物。

背景技術

白介素17（IL-17）是一種炎癥前因子，其家族成員在自身免疫性疾病、移植排斥反應及炎癥中起著重要作用，IL-17普遍存在與Th17細胞、CD8記憶T細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞中，主要來源于Th17細胞家族。IL-17家族成員主要包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17C、IL-17D和IL-17E、IL-17F。目前，研究發現IL-17F在哮喘中扮演重要角色，作為哮喘的促炎因子。IL-17F經常在哮喘病人的氣管中出現，并且其嚴重程度與IL-17F濃度相關；IL-17F可以誘導多種細胞因子，包括趨化因子、粘結因子等；在小鼠IL-17F過量表達時與出現氣管的中性粒細胞增多、和誘導多種相關促炎因子表達增加；IL-17F成為哮喘治療和診斷的主要分子標記。

目前IL-17F的檢測中，目前沒有有效的引物進行檢測，并利用傳統的抗體檢測方法，但是此方法費用較高，花費時間長，并且并利用大范圍的使用。RT-PCR?是研究檢測特定基因表達的一個簡便、準確的方法。通過RT-PCR?在mRNA

水平上檢測某個基因的表達情況，可以提高檢測的準確率。

發明內容

為了解決上述現有技術的不足，本發明目的在于提供用于檢測IL-17F基因表達的引物。

本發明所采用的技術方案如下：

IL-17F基因實時熒光PCR檢測引物，所用的正反引物如下：

正向引物（SEQ?ID?NO.1）:5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3

反向引物（SEQ?IN?NO.2）:5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3。

IL-17F基因實時熒光PCR檢測試劑盒，其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括：SYBR?Premix?Ex?Taq?II（2×）、、正向引物10μM、反向引物10μM。

所述的正向引物和反向引物為上述的引物。

IL-17F基因實時熒光PCR檢測方法，具體步驟為：

?1）提取RNA，并反轉錄為cDNA；

?????2）反應體系：取2μl?步驟1）制得的模板cDNA?溶液，加入上述試劑盒中的溶液12μl，再加入滅菌超純水至總體積20μl?；將以上各組分加入至0.2mL?實時熒光PCR?反應管中，短暫離心；

3）實時熒光PCR?檢測，具體反應提交如下：

95℃?/10s，1?次循環；95℃?/50s，66℃?/60s，40?次循環。

本發明采用SYBR?Green?I?實時熒光PCR?檢測方法，對IL-17A基因進行鑒定，具有檢測實時性和高效性，并可以對早期IL-17A基因表達進行檢測，用于早期判斷自身免疫性疾病，另外可以對病人進行個性診斷和治療過程中，IL-17A的基因表達情況的檢測，并判斷病人復發和加重病情的可能性。

附圖說明

附圖1為檢測樣品1-6實時熒光PCR檢測曲線；

附圖2為檢測樣品1-6和陰性對照對比圖表。

具體實施方式

結合實施例對發明申請做進一步的說明。

設計IL-17F基因實時熒光PCR檢測引物，所用的正反引物如下：

正向引物（SEQ?ID?NO.1）:5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3

反向引物（SEQ?IN?NO.2）:5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3。

IL-17F基因實時熒光PCR檢測試劑盒，其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括：SYBR?Premix?Ex?Taq?II（2×）、、正向引物10μM、反向引物10μM。

實施例1

1）提取6位哮喘病人血清樣品，標記為1-6，2位正常人血清作為陰性對照；分別提取各樣品的RNA，并反轉錄為cDNA，低溫保存備用。

2）取步驟1）中所述的取2μl?步驟1）制得的模板cDNA?溶液，加入上述試劑盒中的溶液12μl，再加入滅菌超純水至總體積20μl?；將以上各組分加入至0.2mL?實時熒光PCR?反應管中，短暫離心；

3）實時熒光PCR?檢測，具體反應提交如下：

95℃?/10s，1?次循環；95℃?/50s，66℃?/60s，40?次循環。

結果分析：

對得到實時熒光PCR檢測的曲線進行分析；并對檢測樣品和陰性對照的熒光進行分析。