[發明專利]一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對及其應用

有效

• 申請號: 201310504021.2
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN103525950A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 孟繼鴻;余文敏
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 沈振濤

技術領域

本發明屬于病毒核酸檢測領域，特別涉及一種用于單管二重一步法鑒別手足口病病原CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，還涉及該利用該引物的應用。

背景技術

手足口病（hand?foot?and?mouth?disease，HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，主要發生于3歲以下兒童，臨床表現為手、足、口腔等部位的皰疹。2012中國疾病控制中心公布全國共發生手足口病2198442例，死亡709人。引起手足口病的腸道病毒有多種，如柯薩奇病毒A組的16、4、6、10、12，柯薩奇病毒B組的2、3、5，埃可病毒的4、19、30，以及腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）等。在我國，根據以往的流行病學監視，EV71和CVA16是引起手足口病爆發的主要病原，在不同年份、不同地點循環反復出現，但2011年9-12月其他腸道病毒構成明顯增加。Yang?F等對中國不同地區手足口病進行研究，發現CVA6（柯薩奇病毒A6型）和其他腸道病毒感染有增加趨勢。Lu?QB等人發現腸道病毒CVA6和CVA10可能成為中國手足口病新的流行病原。2012年8-12月江西九江市爆發手足口病，本實驗室在九江共收集到704份（每人一份）手足口病咽拭子標本和200份病人血清，通過RT-PCR檢測咽拭子標本，測序證實CVA6感染512份。我國CVA6引起的手足口病正在逐年增多，病情復雜，而且在我國九江地區已出現爆發流行。由于其他地區的人群缺少CVA6的抗體，再加上不同地區的人員流動大，很可能會向其他地區擴散。CVA6已逐漸成為引起手足口病爆發的主要病原之一。

CVA6感染和其他腸道病毒感染在臨床癥狀上差別較大，CVA6感染患者分布部位廣，均出現手足口和臀部密集的大皰狀皮疹，還可伴指甲脫落和指端皮膚表層脫皮，此外呼吸道癥狀、消化道癥狀、肝功能受損較EV71、CVA16型多，但是心血管和神經系統的損害較少、較輕。早期、快速、簡便、準確地鑒別CVA6型和非CVA6型手足口病，對于積極的臨床救治和疫情防控具有重要意義。

傳統的病原學診斷采用細胞培養分離和鑒定病毒的手段，耗時且操作復雜，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。分子生物學的進展開拓了腸道病毒的快速診斷技術，特別是PCR技術，由于其具有檢測材料用量少、快速、靈敏度高、特異性好等特點，在病毒感染的診斷中發揮越來越重要的作用。RT-PCR技術已成為手足口病病原體快速診斷的重要手段，市場上已有EV71、CVA16和腸道病毒（EV）的商業化PCR試劑盒，但特異性診斷CVA6的PCR試劑盒尚未出現。此外，只檢測一種病原的RT-PCR，很容易造成其它病原體的漏診；若要同時檢測多種病原，則每個檢測都要單獨進行，要使用多個PCR管，繁瑣費時、試劑消耗大、操作步驟多、容易造成實驗失敗和PCR污染。如能建立一種特異性好、靈敏度高的單管二重一步法RT-PCR，鑒別CVA6型和非CVA6型手足口病，將具有廣泛的應用前景。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于提供一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物。

本發明的第二目的在于提供上述引物在單管二重一步法檢測CVA6和非CVA6腸道病毒中的應用。

技術方案：本發明提供的一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，包括：

上游引物序列為：5’-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’；

下游引物序列為：5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’；

其中R為A或G，M為A或C。

本發明還提供了一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的雙重一步法引物，包括權利要求1所述的RT-PCR引物對以及腸道病毒通用引物。

其中，所述腸道病毒通用引物為：

引物F序列為：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’；

引物R序列為：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’；

其中，W為A或T。

本發明還提供了上述用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對在CVA6和非CVA6腸道病毒檢測中的應用。

本發明還提供了一種包括權利要求1所述的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對的試劑盒。