[發明專利]一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法

無效

• 申請號: 201310503959.2
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN103509792A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 牛東紅;李家樂;謝淑媚;王劦;趙弘剛
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

1.一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）.縊蟶微衛星序列的篩選步驟

利用新一代454測序技術獲得縊蟶轉錄組數據庫，按照兩堿基重復次數>6,三堿基重復次數>4,四、五、六堿基重復次數>3的微衛星長度標準，利用SciRoKo軟件在縊蟶轉錄組數據庫所有序列中篩選縊蟶微衛星序列，利用Primer3軟件在縊蟶微衛星序列的側翼序列設計引物；

2).縊蟶基因組DNA的提取步驟

取0.2g縊蟶外套膜組織于裂解液中，利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，用0.8%的瓊脂糖膠電泳檢測；

3）.微衛星引物的適用性擴增步驟

采用上述DNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增產物經1.2％瓊脂糖凝膠檢測，于凝膠成像系統下觀察并拍照記錄；

4）.縊蟶適用性微衛星標記的鑒定步驟

檢測符合微衛星擴增效果的正向引物采用FAM熒光染料標記，之后進行PCR擴增，擴增產物采用ABI3730核酸分析儀檢測，并利用GeneMapper軟件(Applied?Biosystems)進行基因型分析。

2.如權利要求1所述的快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，其特征在于，所述步驟2）中，所述利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，具體如下：

A.取0.2g縊蟶外套膜組織，溶解于裂解液中，徹底裂解至澄清；

B.在裂解液中加入500uL苯酚，12000rpm離心20min；

C.吸取上清液，加入500uL氯仿，12000rpm離心20min；

D.吸取上清液，加入2倍體積預冷無水乙醇，靜置30min,12000rpm離心20min；

E.棄掉上清液，將DNA溶解于100uL無菌水中，-20℃保存備用。

3.如權利要求1所述的快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，其特征在于，所述步驟3）和4）所述PCR擴增具體如下：

PCR反應體系為25μL，含1×MIX，上、下游引物各0.2μmol/dm³，模板DNA20ng；PCR反應條件：94℃預變性3min，（94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s）進行30個循環，最后72℃延伸10min。