[發明專利]糖基化多肽及其與載體蛋白的偶聯物及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201310503612.8
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN104558112A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 段學軍;楊彬;胡昕芳;郭振剛;鐘嘯;李元光;何偉
• 申請（專利權）人: 北京怡成生物電子技術股份有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K19/00;G01N33/72
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾

技術領域

本發明涉及一種糖基化多肽及其與載體蛋白的偶聯物及其制備方法與應用，所述的糖基化多肽或其與載體蛋白的偶聯物能代替昂貴的人糖化血紅蛋白抗原純制品制備層析試條（試紙條），該層析試條能快速、精確、定量、簡便的檢測全血中的糖化血紅蛋白。

背景技術

糖尿病是一組病因和發病機制尚未完全明了的內分泌代謝疾病，目前發病率僅次于心血管疾病和腫瘤。根據醫學雜志《The?New?England?Journal?of?Medicine》2010年3月報道，我國的糖尿病患者數目已達9200萬。目前臨床已廣泛開展檢測患者血糖工作，實現了醫院大型生化分析儀集中監測和患者使用手持式血糖儀家庭式即時檢測的立體網絡。但是，血糖測定只是代表即刻的血糖水平，提示患者當時的身體狀況，并不能作為評價疾病控制程度的指標。

近年來，糖化血紅蛋白（HbA1C）的檢測日益受到臨床的高度重視。HbA1C是指血液中和葡萄糖結合了的那一部分血紅蛋白。當血液中葡萄糖濃度較高時，人體所形成的糖化血紅蛋白含量也會較高。人體內紅細胞的壽命一般為120天，在紅細胞死亡之前，血液中HbA1C含量也保持相對不變。因此HbA1C水平反應了檢測前120天內的平均血糖水平，而與取血時間、病人是否空腹及是否使用胰島素等因素無關，是判定糖尿病長期控制的良好指標。

常用的糖化血紅蛋白檢測方法有微柱法離子交換層析、親和層析、高壓液相、免疫凝集、離子捕獲法、電泳法等。醫院大型生化分析儀主要采用基于高效液相層析法原理的檢測方法，使用陽離子交換柱通過與不同帶電離子作用來將血紅蛋白組分分離。利用不同鹽濃度所形成的梯度洗脫液使得包括血紅蛋白A1c在內的血紅蛋白中的多種成分很快被分離成多個部分，并用檢測器對分離后的各種血紅蛋白組分的吸光度進行檢測。分析結束后，以百分率表示的各種血紅蛋白組分結果與層析圖一起被傳送到打印機，但是檢測過程需要專業操作人員；儀器比較大，不適合即時、就地監控糖化血紅蛋白水平。

CN101622541A公開了一種糖化血紅蛋白定量檢測系統及使用該系統檢測糖化血紅蛋白含量的方法，其中能同時檢測血液中血紅蛋白和糖化血紅蛋白的系統裝置包括側流分析檢測試紙條、用于檢測來自所述試紙條上固定捕捉物區域的熒光信號的激光誘導表面熒光檢測器、以及用于檢測染料分析物的LED檢測器，所述側流分析檢測試紙條是通過設置糖化血紅蛋白，通過競爭性免疫反應與樣品中的分析物通過抗原-抗體反應結合。然而，人糖化血紅蛋白抗原純制品非常昂貴，從而一定程度上限制了該檢測技術的應用。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種新的糖化血紅蛋白類似物的設計方案及制備方法，并采用該糖化血紅蛋白類似物制備快速檢測糖化血紅蛋白的層析試條，利用該層析試條，可以快速、定量、簡便的檢測全血中的糖化血紅蛋白含量。

首先，本發明提供了一種新的糖化血紅蛋白類似物，本發明設計的糖化血紅蛋白類似物可以代替昂貴的人糖化血紅蛋白抗原純制品用于制備檢測糖化血紅蛋白的層析試條，與待檢樣本中的人糖化血紅蛋白抗原競爭結合人糖化血紅蛋白抗體。具體地，本發明設計的一種糖化血紅蛋白類似物是一種糖基化多肽，該糖基化多肽具有如下所示的序列結構：

Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys。

該糖基化多肽可以按照現有技術的方法首先合成糖基化的纈氨酸、然后再按照常規多肽合成的方法逐次偶聯上上述序列的氨基酸而制備獲得。該糖基化多肽可在4℃保存備用。

另一方面，本發明還提供了一種糖基化多肽與載體蛋白的偶聯物，該偶聯物是本發明所述的糖基化多肽的末端Cys偶聯載體蛋白后的產物。本發明的糖基化多肽與載體蛋白的偶聯物也可作為一種糖化血紅蛋白類似物代替昂貴的人糖化血紅蛋白抗原純制品用于制備檢測糖化血紅蛋白的層析試條，與待檢樣本中的人糖化血紅蛋白抗原競爭結合人糖化血紅蛋白抗體。

根據本發明的具體實施方案，其中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA）、肌紅蛋白、或血藍蛋白（KLH），優選為牛血清白蛋白。

另一方面，本發明還提供了所述糖基化多肽與載體蛋白的偶聯物的制備方法，該方法包括：

將所述載體蛋白如牛血清白蛋白（BSA）經SMCC修飾，在水溶液中反應活化所述載體蛋白，獲得活化的載體蛋白（載體蛋白-SMCC）溶液；

將所述糖基化多肽溶解于含0.1M?EDTA的0.1M?pH7.2PBS溶液中；

將上述糖基化多肽溶液加入到活化的載體蛋白溶液中，混合均勻得混合液，室溫放置1～3h；