[發(fā)明專利]一種仔豬腹瀉抗性相關(guān)的分子標(biāo)記檢測方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310502527.X
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN103525822A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何俊;張珈榕;馬海明;蔣雋;賀長青
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務(wù)所 43008
• 代理人: 江巨鰲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種包含如SEQ?ID?NO：1所示仔豬基因核苷酸的核酸分子。本發(fā)明還涉及如SEQ?ID?NO：1所示的多核苷酸序列中的單核苷酸多態(tài)性位點以及檢測所述單核苷酸多態(tài)性位點的方法。

背景技術(shù)

研究表明，GPI與生物體很多疾病有關(guān)。已知的與人沉積在老年性癡呆、感染性蛋白質(zhì)疾病(包括人的Creutzfeld-Jakob病，Gerstmann-straussler-scheinker綜合癥，庫魯病和綿羊及山羊的瘙癢癥等)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、非洲昏睡病、瘧疾、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥、慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等有直接關(guān)系。

在白念珠菌耐藥基因研究中，GPI1被認為與耐藥有關(guān)(麻志萍等，2008)。在朊蛋白的有關(guān)研究中，GPI錨定位點的移除可減少對感染性朊蛋白疾病的易感性，保護了可溶性的PrPc轉(zhuǎn)變?yōu)橹С指腥拘噪玫鞍讖?fù)制的分子(張?zhí)瑁?008)。還有研究表明，缺氧狀態(tài)下，YC-1抑制人胰腺癌PC-3細胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和GPI基因轉(zhuǎn)錄與其抑制HIF-1α蛋白的表達有關(guān)，YC-1能夠抑制人胰腺癌PC-3細胞生長和增殖。同時有實驗表明，在鼠的肝臟內(nèi)腔隙中存在GPI-PLD，在移去肝臟以后，酶的活性明顯下降，在緊接著移植入肝后，酶的活性明顯增加，在嚴(yán)重肝疾病時，酶的活性依賴于肝的合成儲備功能，說明肝是其主要來源。在病毒性肝炎及支氣管炎肺炎時，其活性明顯上升，說明GPI-PLD也可作為一個急性期反應(yīng)物。競爭性RT-PCR監(jiān)測在不同惡性程度腫瘤細胞中GPI-PLD?mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)釋放大量腫瘤可溶性預(yù)后標(biāo)記物的卵巢癌細胞與釋放少量標(biāo)記物的卵巢癌細胞相比，其GPI-PLDmRNA的表達水平明顯增加(Xiao?Guang-fen，2010)。

人的GPI1基因包含11個外顯子，定位于16pl3.3，靠近α血紅蛋白基因座，GPI1基因在組織和細胞中的表達無所不在，尤其在骨髓、胎兒肝臟等造血組織中的表達顯著高于其他組織。GPI1基因目前已被確認是GPI生物合成的必需組成部分。GPI編碼產(chǎn)物與糖基磷脂酰肌醇的合成密切相關(guān)。在生物體的免疫、代謝等多個方面發(fā)揮重要的作用。可以預(yù)見，由于GPI1基因?qū)τ贕PI合成的重要性，GPI1基因?qū)τ谏矬w的疾病有著非常重要的調(diào)控作用。而目前對豬GPI1基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究卻還不太深入。

本發(fā)明選擇豬GPI1基因作為豬腹瀉抗性性狀的候選基因，以3個外來豬種(杜洛克豬、大白豬、長白豬)和1個本地豬種（寧鄉(xiāng)豬）為試驗材料，采用PCR-RFLP方法對GPI1基因G/T位點的基因頻率、基因型頻率進行檢測，并分析其遺傳結(jié)構(gòu)，初步探討該基因與腹瀉抗性性狀的相關(guān)性。目前國內(nèi)外關(guān)于豬GPI1基因的相關(guān)研究很少。本發(fā)明將找到與仔豬腹瀉抗性有關(guān)的遺傳標(biāo)記，為篩選ETEC?F4抗性豬提供可行的標(biāo)記輔助選擇方法，為選育ETEC?F4抗性豬配套系提供理論研究依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于找到與仔豬腹瀉抗性有關(guān)的遺傳標(biāo)記，為篩選ETEC?F4抗性豬提供可行的標(biāo)記輔助選擇方法，為ETEC?F4抗性豬的早期選種提供依據(jù)，為選育ETEC?F4抗性豬配套系提供理論研究依據(jù)。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

利用比較基因組學(xué)方法，根據(jù)發(fā)明人提交到GenBank的GPI1基因序列（收錄號為JX125039）和人的GPI1基因的保守區(qū)設(shè)計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)SNP，并利用PCR－RFLP進行基因分型，再利用獨立性卡方檢驗對檢測的該基因SNPs與腹瀉抗性的關(guān)聯(lián)度進行分析，以檢驗該SNPs的實際應(yīng)用效果。

（1）PCR引物設(shè)計與序列獲得

利用Primer?Premier軟件，根據(jù)不同物種的GPI1基因的保守序列制備了檢測上述序列表SEQ?ID?NO：1基因片段突變的引物對，所述的引物對的正向引物為5′-CTTGGAGCTAAG?CAGTGATGTG-3′，反向引物為5′-CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3′。該引物對的退火溫度為62℃，以豬的基因組DNA為模板，構(gòu)建20μL的擴增體系，經(jīng)過預(yù)變性、變性－退火－延伸33個循環(huán)以及后延伸的反應(yīng)過程，獲得了目的片段，片段核苷酸序列如序列表SEQID?NO：1所述。

（2）SNP發(fā)現(xiàn)與檢測方法建立