[發明專利]提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒及相應的提取方法

無效

• 申請號: 201310502121.1
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN103509788A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 王世杰;薛玉玲;朱宏
• 申請（專利權）人: 石家莊君樂寶乳業有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/245;C12R1/25;C12R1/01
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務所 13113
• 代理人: 張紅衛;左燕生

1.一種提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒，其特征在于它包括以下試劑：?

??Buffer-1為質量百分比為10%的十二烷基硫酸鈉溶液；

??Buffer-2為150～200mg/mL?的溶菌酶，用無菌水配制；

??Buffer-3為15～20mg/mL的蛋白酶K，用20mM?Tris-HCL配制，其pH值為7.5；

??Buffer-4為10mol/L?CTAB，由4.1g?NaCl溶于80mL水中，再緩慢加入10g?CTAB?配制而成；

??Buffer-5為5M?NaCl溶液；

??Buffer-6為10mM?Tris-HCl，1?mM?EDTA，0.1mg/mL?RNaseA；

其它試劑：體積比為25:24?:1的苯酚：氯仿：異戊醇混合的抽提液；

??異丙醇；

??體積百分比為70%的乙醇。

2.一種提取乳酸菌基因組DNA的方法，其特征在于它按照以下步驟順序進行：

（1）取對數生長期的乳酸菌菌液3mL，于12000rpm離心1min收集菌體，菌體用Buffer-6洗滌兩次，后用500μL?Buffer-6重懸菌體，得菌體懸濁液1；

（2）將菌體懸濁液1中加入50μL?Buffer-1和20μL?Buffer-2溶液，37℃，溫箱溫育1h，裂解細胞壁，得菌體懸濁液2；

（3）將菌體懸濁液2中加入10?μL?Buffer-3，混勻后于55℃溫箱過夜消化，使蛋白變質或降解，得菌體懸濁液3；

（4）將菌體懸濁液3中加入100μL?Buffer-4和100μL?Buffer-5溶液，混勻，65℃水浴加熱15min，沉淀蛋白，得菌體懸濁液4；

（5）用等體積的抽提液將菌體懸濁液4抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心10min，取上清液，得上清液5，再使用等體積的抽提液將上清液5抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心10min，取上清液，得上清液6；

（6）將上清液6用0.8倍體積的異丙醇沉淀基因組DNA，得沉淀7；?

（7）沉淀7用70%乙醇洗滌沉淀2次，抽干后用30?μL?Buffer-6溶解沉淀，最終得乳酸菌基因組DNA溶液。