[發明專利]一種高通量的連續性核酸擴增裝置及方法

無效

• 申請號: 201310502008.3
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN103602659A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 王淑軍;楊錦宇;管雷
• 申請（專利權）人: 楊錦宇
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12M1/38;C12M1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明提供了一種PCR擴增反應用的裝置，屬于生化設備技術領域。

背景技術

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

自perkin?–elmercetus公司第一臺pcr擴增儀問世以來，現已有幾十家不同的廠家在國內外生產和銷售pcr擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經過幾代的發展，不斷采用新技術，并且進一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發展。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

熒光定量PCR(?realtime?fluores-cence?quantitative?PCR，RTFQ?PCR)?是1996?年由美國Applied?Biosystems?公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度全同步。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時,?探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成。

目前PCR技術雖然的到了很大的發展，但是所有的PCR反應都必須在PCR反應管中實現，這樣，單獨的PCR反應的體系就不能超過200微升，這就限制了特定基因的大量制備；同時，目前的PCR儀器擴大擴增的通量主要依靠增大反應的孔的數目，目前高通量的PCR儀器已經做到了384孔，可以同時擴增或者定量384個樣品，但是面對上千或者上萬的樣品的擴增和檢測，就比較困難了;傳統PCR反應時間通常為2小時以上，這其中大部分的時間被用在溫度的變化上。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術當中PCR擴增操作步驟繁瑣、擴增量受到限制、無法連續操作的問題，提供了一種具有高通量的連續性PCR擴增方法，采用了如下的技術方案：

一種高通量的連續性核酸擴增方法，包括如下步驟：使PCR反應物料沿毛細管流動，通過毛細管外部設置的多個溫控區域對反應物料的溫度進行調節，使PCR反應物料依次經過變性、退火、延伸過程，完成PCR擴增反應。