[發明專利]一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細胞的方法

有效

• 申請號: 201310500133.0
• 申請日: 2013-10-13
• 公開（公告）號: CN103725647A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 易銀沙;張萬明;朱海強;鄒義洲;許澎;李娜;劉彩云;袁炳秋;吳小寧
• 申請（專利權）人: 長沙贏潤生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細胞的方法，其特征是，包括以下步驟：?

(1)從紅斑狼瘡患者的非發病期采集100ml外周靜脈血?

針對紅斑狼瘡患者，在患者病情穩定期無癥狀時，使用醫療采血技術采取100ml血液到采血袋中，如果是初次患者，可以立即采血或者在癥狀穩定后，使用醫療采血技術采取100ml血液到采血袋中，采血后的采血袋放入4℃環境中運輸，2h內使用；?

(2)血液中分離得到單個核細胞?

1)取100ml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離心管中；?

2)對抗凝處理后的血液進行離心，離心后，得到上層血漿層和下層血細胞層吸掉上層血漿；?

3)向該4個下層含血細胞的離心管中加入注射用生理鹽水，用移液器混勻；?

4)再取4支含有淋巴細胞分離液的離心管，緩慢的將血細胞混合液用移液器轉移到淋巴細胞分離液的上層；?

5)進行離心；?

6)離心后將中間白膜層吸入到新的離心管中；?

7)用注射用生理鹽水補液后，再次進行離心，清洗單核細胞；?

8)重新加入注射用生理鹽水，混勻后離心清洗單核細胞；?

(3)用混合酶消化液除去殘留抗原，凈化單個核細胞?

1)準備胰酶和膠原酶Ⅲ的混合消化液，加入到上一步中剩下的離心管中，吹勻，消化一段時間后，加入注射用生理鹽水，混勻后，進行離心；?

2)準備DNA酶液，消化上一步剩下的細胞，再加入注射用生理鹽水，進行離心清洗細胞；?

3)最后得到的即無自身抗原的單個核細胞，用無血清培養液培養。?

2.根據權利要求1所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細胞的方法，其特征是，所述外周靜脈血必須按照醫院進行醫療級別抗凝血處理。?

3.根據權利要求1所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細胞的方法，其特征是，所述單個核細胞是一類具有近似密度的細胞群，是血細胞層通過密度梯度分離法分離到的白膜層細胞，密度梯度分離法所用的分離液密度是1.077g／ml。?

4.根據權利要求1所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細胞的方法，其特征是，所述注射用生理鹽水屬于醫療試劑，實驗室使用磷酸鹽緩沖液代替。?

5.根據權利要求1或4所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血中分離無自身抗原的單個核細胞的方法，其特征是，所述混合酶消化液有兩種，第一種為胰酶和膠原酶Ⅲ的混合液，第二種為DNA酶。混合消化液中酶的作用是消化液體中細胞外的游離蛋白和DNA存在，包括可能致病的抗原和抗體。?

6.根據權利要求5中所述的DNA酶可以是任何降解DNA，使其完全失去鏈狀結構，且同時對細胞沒有影響的蛋白酶類，可以是一種或者多種酶的組合。?