[發(fā)明專(zhuān)利]一種產(chǎn)白藜蘆醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310499812.0
• 申請(qǐng)日: 2013-10-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103540561A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);周景文;吳俊俊;堵國(guó)成
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/63;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種產(chǎn)白藜蘆醇的基因工程菌，其特征在于，是在Escherichia?coli(BL21)中表達(dá)了白藜蘆醇合成途徑中的關(guān)鍵酶系：酪氨酸脫氨酶TAL、4-香桂酸：輔酶A連接酶4CL、芪合酶STS、丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶matC以及丙二酸吸收酶matB，以酪氨酸為底物合成白藜蘆醇。

2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，編碼所述丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，編碼所述丙二酸吸收酶的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼所述酪氨酸脫氨酶的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，編碼所述4-香桂酸：輔酶A連接酶的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，編碼所述芪合酶的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

3.權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述5個(gè)基因通過(guò)3個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行共表達(dá)，所述3個(gè)質(zhì)粒為：（1）pCDFDuet-1攜帶編碼酪氨酸脫氨酶TAL和4-香桂酸：輔酶A連接酶4CL的基因，得到質(zhì)粒pCDF-RgTAL-Pc4CL，（2）pETDuet-1攜帶編碼芪合酶STS的基因，得到質(zhì)粒pET-STS，（3）pACYCDuet-1攜帶編碼丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)、丙二酸吸收酶的基因matB、matC，得到質(zhì)粒pACYCD-matB-matC。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述pCDFDuet-1采用啟動(dòng)子Trc，質(zhì)粒拷貝數(shù)為20；所述pETDuet-1采用啟動(dòng)子為T(mén)7，質(zhì)粒拷貝數(shù)為40；所述pACYCDuet-1采用啟動(dòng)子T7，質(zhì)粒拷貝數(shù)為10。

5.構(gòu)建權(quán)利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）采用全基因合成方法獲得途徑所需要的五個(gè)基因；

（2）通過(guò)酶切連接構(gòu)建得到三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-STS，pACYCD-matB-matC，測(cè)序驗(yàn)證后，將三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒以化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.coli(BL21)感受態(tài)細(xì)胞；

（3）挑選能在含有100ug/mL的氨芐、35ug/mL的氯霉素、50ug/mL的鏈霉素三種抗生素LB平板上生長(zhǎng)的菌落，使其在含上述的三種抗生素的LB平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，得到遺傳穩(wěn)定的重組子，進(jìn)一步PCR驗(yàn)證五個(gè)途徑基因已成功轉(zhuǎn)入到E.coli(BL21)中。

6.應(yīng)用權(quán)利要求4所述基因工程菌生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其特征在于，是將構(gòu)建得到的基因工程菌接種到MOPS培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37℃、250rpm條件下培養(yǎng)12-20h至菌株OD₆₀₀達(dá)到1.0-2.0；然后加入25ml相同的MOPS培養(yǎng)基及終濃度為1mM的IPTG，30℃，250rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)60h。

7.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)6所述的方法，其特征在于，MOPS培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖5，氯化銨9.1，磷酸氫二鉀0.3，丙二酸2，MOPS83.7，N-{三（羧甲基）甲基}甘氨酸7.1668，硫酸鐵0.03，硫酸鉀0.5，氯化鎂1.1，氯化鈉29.2，微量元素10ml，自來(lái)水定容。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述微量元素采用ATCC?BAA-232的配方。