[發(fā)明專利]用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組應(yīng)用及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310499617.8
• 申請日: 2013-10-22
• 公開（公告）號: CN103614490A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王友令;楊金興;袁小遠(yuǎn);徐懷英;張玉霞;劉軍河;韓曉珺;董偉峰
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 徐槐

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及禽流感病毒的檢測，尤其涉及用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組、該引物組的應(yīng)用以及檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP試劑盒。

背景技術(shù)

流感病毒（Influenza?virus）屬于正粘病毒科流感病毒屬，根據(jù)NP?蛋白和M?蛋白的不同可將其分為甲、乙和丙三型。流感病毒基因組是由8?條負(fù)鏈RNA?節(jié)段組成，編碼11?或12?個蛋白，其中兩個糖蛋白血凝素蛋白HA?和神經(jīng)氨酸酶蛋白NA?較為重要，二者位于病毒粒子表面。病毒RNA?與核糖核蛋白及三個RNA?依賴的RNA?聚合酶亞基PB2、PB1?和PA?相連。已知甲型流感病毒已在多種動物體內(nèi)分離到，包括人、豬、馬、鯨、海豹和鳥類等。根據(jù)其血清學(xué)檢測，現(xiàn)已經(jīng)鑒定出17?個HA?亞型（H1-17）和9?個NA?亞型（N1-9）。

根據(jù)毒力大小的不同，流感病毒可分為低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI），已知的17個HA?和9?個NA?亞型均能在水禽中分離到，其中僅H5?和H7?亞型的部分毒株屬于HPAI，其余均屬于LPAI。所有人類的流感病毒都可以引起禽類流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人類流感。禽流感病毒中，H5、H7、H9可以傳染給人，其中H5為高致病性。2005?年，中國西部青海湖地區(qū)發(fā)生了水禽感染HPAI?的H5N1，導(dǎo)致野鳥大面積死亡，所以要注意到遷徙鳥中的HPAI??H5N1?流感病毒的潛在危險(xiǎn)。隨后，在東南亞不同地區(qū)都出現(xiàn)了基因型和抗原性不同的新型HPAI??H5N1，并在家禽中廣泛流行。同時(shí)亦不能忽視家禽轉(zhuǎn)運(yùn)和鳥類遷徙過程在HPAI?H5N1?的遠(yuǎn)距離傳播中的作用，這也解釋了歐洲、中東和非洲地區(qū)等地區(qū)頻繁暴發(fā)禽流感的可能原因。

流感病毒的HA?蛋白對受體的特異性和親和力是決定宿主嗜性和傳播能力的關(guān)鍵因素之一。1918?年H1N1?流感病毒會受HA?蛋白上190?和225?位氨基酸的影響；D225G?突變體下降了α2,6?唾液酸結(jié)合的親和力，導(dǎo)致與人氣管中杯狀細(xì)胞的結(jié)合力下降，從而使病毒在雪貂中的傳播能力下降。同時(shí)H5N1?病毒在識別不同的受體結(jié)合特性是由不同的氨基酸殘基引起的。同樣，在受體結(jié)合位點(diǎn)附近的殘基差異使其它禽或流行的流感病毒的受體結(jié)合特性變得更加復(fù)雜，表明在不同的HA?亞型中受體的特異性是不同的。

我國一直被認(rèn)為是禽流感的高發(fā)和易發(fā)地，經(jīng)常是多種亞型AIV并存的情形。LPAIV?不像HPAIV?可引起野鳥和家禽的大面積死亡，但仍然存在較多的潛在危險(xiǎn)，如重組變異形成新的病毒等。因此LPAIV?仍然需要相當(dāng)?shù)闹匾暋?/p>

H4?亞型AIV?屬于LPAIV，國內(nèi)分離到的毒株較少，因此對之研究較少。國際上目前有韓國、俄羅斯等國家均報(bào)道分離到該亞型。哺乳動物分離到的該病毒是1999?年在加拿大豬體內(nèi)分離到一株H4N6?病毒，序列分析表明，其各病毒節(jié)段均為禽源，但HA?基因的226L的特征使該病毒具有了感染豬的能力，由此暗示H4亞型病毒可能在哺乳動物體內(nèi)逐漸適應(yīng)。

目前，H4流感病毒檢測主要依賴病毒分離和分子生物學(xué)檢測，但是不能進(jìn)行敏感特異快速的檢測方法。所以目前為止還沒有確定一種最具有臨床使用價(jià)值的基層分子生物學(xué)診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組，還提供了上述的用于檢測H4亞型禽流感病毒RT-LAMP的試劑盒。

用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組，該RT-LAMP引物組其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2?、SEQ?ID?NO.3、?SEQ?ID?NO.4所示。

上述的RT-?LAMP引物組在制備檢測或診斷H4亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途、在制備檢測或診斷鴨坦布蘇病毒的生物試劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。

用于檢測H4亞型禽流感病毒RT-LAMP的試劑盒，包括反應(yīng)混合液、酶混液和蒸餾水，該試劑盒還包括熒光檢測試劑及權(quán)利要求1所述的引物組。

H4亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測的試劑盒在制備檢測或診斷H4亞型禽流感病毒的生物試劑中的應(yīng)用、制備檢測或診斷鴨坦布蘇病毒的生物試劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。