[發(fā)明專利]排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310496295.1
• 申請(qǐng)日: 2013-10-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103540666A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇秀榕;周君;張春丹;李曄;王中華;李春麗;張迪駿;何偉娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于步驟如下：?

a、陰溝腸桿菌抗體溶液制備：挑取陰溝腸桿菌單個(gè)菌落接種于由胰蛋白酶酶解的酪蛋白大豆液-瓊脂液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，7000～8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用生理鹽水水洗1次，再用生理鹽水懸浮，加入質(zhì)量百分濃度為0.5%～1%的甲醛過(guò)夜；次日7000～8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用生理鹽水洗3次，并用生理鹽水分別配成濃度為10⁷～10⁹?cfu?/ml陰溝腸桿菌菌液和濃度為10¹⁰?cfu?/ml陰溝腸桿菌菌液，將濃度為10⁷～10⁹?cfu?/ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，間隔一周，用濃度為10⁷～10⁹?cfu?/ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用濃度為10¹⁰?cfu?/ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37℃下溫育0.5h，4℃下3000轉(zhuǎn)?/?分離心15min，得上清，該上清為陰溝腸桿菌抗體溶液；

b、免疫磁珠溶液制備：取100～200μl羧基磁珠置于離心管中，加入500?μL活化緩沖液，在漩渦振蕩器上混合均勻，將離心管放置于磁分離架上，待納米磁珠完全被吸附于離心管壁，移出管中液體，用活化緩沖液洗滌納米磁珠一次，洗滌后在離心管中加入活化緩沖液500μl、碳二亞胺0.5mg和N-羥基琥珀酰亞胺1mg，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫下活化20?min，移出管中液體，得到活化磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌活化磁珠二次，洗滌后在離心管中加入濃度為6?mg/ml的上述陰溝腸桿菌抗體溶液15μl，室溫下反應(yīng)3?h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌免疫磁珠二次，然后加入含有質(zhì)量百分濃度1％牛血清白蛋白的偶聯(lián)緩沖液500μl封閉免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化緩沖液為pH為6.0含有吐溫-20的NaH₂PO_4?溶液，所述偶聯(lián)緩沖液為pH為7.4含有吐溫-20的NaH₂PO_4?溶液，所述活化緩沖液和所述偶聯(lián)緩沖液中，NaH₂PO₄濃度為0.01M，吐溫-20的質(zhì)量百分濃度為0.05%；

c、待測(cè)樣品富集：取排污口水樣2ml于試管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室溫輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min，移出試管中液體，用磷酸緩沖液洗滌免疫磁珠3～5次，洗滌后加入0.5ml無(wú)菌水，將試管置于磁性細(xì)胞分離架上磁性分離3min，取出免疫磁珠，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液；

d、DNA模板制備：待檢樣品溶液用DNA提取試劑盒提取DNA，得到DNA模板，具體提取依DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

e、PCR檢測(cè)：30μl的PCR反應(yīng)體系為：10×PCR?緩沖液2.5μl，濃度25mM的MgCl₂液1.5μl，濃度10mM的dNTP液1.5μl，濃度5U/μl的T?aq?DNA?聚合酶0.2μl，濃度都為10μM的引物irp2-F、irp2-R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R、Slt-F、Slt-R各1.0μl，上述DNA模板2μl，余量為雙蒸水；PCR反應(yīng)條件為94°C變性5?min，94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10?min；PCR反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量百分濃度1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個(gè)目的基因片段，則排污口水體中含有陰溝腸桿菌，所述引物irp2-F的核苷酸序列為：AAGGATTCGC?TGTTACCGGA?C，所述引物irp2-R的核苷酸序列為：AACTCCTGAT?ACAGGTGGC，所述引物FhuA-F的核苷酸序列為：CAGCAGAACA?ACCGAAGCAA?GA，所述引物FhuA-R的核苷酸序列為：TTGAGGTCGT?GGCGTAATCG?T，所述引物SodB-F的核苷酸序列為：ACCACCAGGC?GTATGTCACT?AA，所述引物SodB-R的核苷酸序列為：TGCCGAAAGA?TTTGGCGATT，所述引物Slt-F的核苷酸序列為：CGCAGCCGCT?ACGCACAAAT，所述引物Slt-R的核苷酸序列為：TCGGTTACAT?CGCTACCCAT?CA。